WO2000006724A1

WO2000006724A1 - Medicaments permettant de soigner la neuropathie contenant de la galectine-1 ou ses derives comme substance active

Info

Publication number: WO2000006724A1
Application number: PCT/JP1999/004091
Authority: WO
Inventors: Hidenori Horie; Yoshimasa Inagaki; Yoshiaki Soma; Toshihiko Kadoya
Original assignee: Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2000-02-10
Also published as: EP1122311A1; AU4930299A; US6890531B1; EP1122311A4

Description

明細書ガレクチン— 1 又はその誘導体を有効成分として含む

神経障害用治療剤発明の技術分野

本発明は、神経突起の再生、神経組織の修復等の神経再生促進作用を有するガレクチン一 1又はその誘導体、そのような蛋白質を有効成分とする神経損傷、神経変性、神経移植時機能低下を含む神経障害の治療剤に関する。発明の背景

交通事故等による神経損傷やガンやエイズ等の治療薬による神経損傷や神経障害、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、老年痴呆、アルッハイマー症、パーキンソン病等の末梢神経及び中枢神経系の神経損傷や機能障害については、難治性で、重篤な症状を示す場合が多く、患者を死に至らしめることも少なくないが、現在、効果的な治療薬はない。これらの神経障害では、神経組織の変性、脱落、神経軸索の切断、退行等が起こることから、予防 ' 治療に対しては、神経組織の変性や細胞死を抑制 ύ、神経突起の再生を促進する作用を有する因子が有効な治療薬として期待されている。

約 4 0年前にレヴィ · モンタルティーニらによって神経成長因子 ( NGF ) が発見されて以来、神経細胞に作用する液性の因子として、毛様体神経栄養因子（CNTF ) 、脳由来神経栄養因子（BDNF ) 、ニューロト口フィン一 3 ( ΝΤ- 3 ) 、ニューロトロフィン— 4 Ζ 5 ( ΝΤ-4 / 5 ) 、グリァ由来神経栄養因子（GDNF ) 等の神経栄養因子類やサイトカイン等の中に種々の神経の生存維持や突起の再生に作用する因子があることが分かつてきた。このうちの数種については医薬への適用に向けた研究もなされてきている。ガレクチンはラクトサミン糖鎖に特異的な動物レクチンの総称であリ、

/3 ガラクトシド結合動物レクチン、 Sタイプレクチンとも呼ばれる。腺虫、海綿等の下等な無脊椎動物からトリ、ヒトに至るまでの動物組織の細胞内にその存在が確認されている。このタイプのレクチンは数種見つかり、 1994 年にそれらをガレクチンと総称することが提案された (S. H. Barondes et al， Cell, 76， 597-598, 1994) 。現在までにガレクチンフアミリーとしてガレクチン- 1 からガレクチン- 11 までが報告されている。これらのガレクチンの作用については、細胞増殖、細胞接着に関係している等の報告があるが、その生理的機能についてはまだよく分力つてヽなヽ（ J. Hirabayashi et al.， J. Biochem. , 119， 1-8, 1996； N.L.Perillo et al.，J Mo 1 Med. , 76,402-412, 1998) 。また、ガレクチン -1 に関しては多くの動物種由来フォームの構造も決定されている（ヒ卜ガレクチン- 1 ： J.Hi rabayashi et al. , J. Biochem.， 104, 1-4, 1988 ； J. Hirabayashi et al. , Biochim. Biophys. Acta. , 1008， 85- 91, 1989、ラッドガレクチン - 1 : L Clerch et al.， Biochemistry, 27, 692- 699, 1988、マウスガレクチン - 1 :T. J. G. Wi lson et al.， Biochem. J. , 261, 847-852 , 1989 、ゥシガレクチン - 1 : W.M.Abbot et al. , Biochem. J. ，259,283- 290, 1989) 。特開平第 2-84192 号公報（発明の名称；哺？し動物の 14-0 -gal レクチン類、出願人；アイデオンコ一ポレーシヨン）や国際公開第 W0 94/11497号（ T i 11 e： METHOD OF CAUSING SELECTIVE IMMUNOSUPPRESSION USING HL-60-RELATED

LECTINS, Appl icant: INCYTE PHARMACEUYICALS INC. ) には、ガレクチン- 1 の遺伝子、蛋白、自己免疫疾患治療薬について記載されているが、神経損傷や神経障害等の神経変性疾患の治療薬に関する記載は全くない。一方、ガレクチン- 1 の神経系に関する報告には次に示すものがある。感覚神経の発生期において脊髄後根神経節神経細胞にガレクチン- 1 が発現しているという報告（J.Dodd,et al. J Exp Biol. 124, 225-238, 1986; M. A. Hynes, et al. J. Neurosci. , 10, 1004-1013, 1990 )、脊髄後根神経節神経細胞において、ガレクチン- 1 は細胞接着基質として神経細胞の凝集や神経突起進展に関与しているという報告（R. L. Outenreath et al. , J. Neurocy ol. , 21, 788-795, 1992) 、発生期のラット嗅覚神経系細胞にはガレクチン- 1 が発現しており、細胞接着基質として神経突起進展に関与しているとい報告 (N. . Mahanthappa, et al. Development. 120, 1373-1384， 1994; E. H. Raabe, et al. Brain Res Dev Brain Res. 101, 187-196, 1997) 、マウス嗅覚神経株細胞を用いた培養系において細胞接着基質として神経突起進展に関与しているという報告（A. Puch，et al. Dev Biol. 179, 274-287, 1996) 、数種の神経組織におけるガレクチン- 1 の分布に関する報告（R.Joubert et al, Dev. Neurosci. 11， 397-413, 1989; S.Kuchler et al, Dev. Neurosci. , 11, 14-427, 1989) などである。これらの報告はいずれも神経組織での分布や神経細胞の接着基質としての働きに関しての記述にとどまつており、神経栄養因子や神経系に作用するサイトカイン類のような神経細胞あるいは傍神経系細胞への作用による神経再生促進因子としての記述はない。また、ヒトガレクチン- 1 は分子内に 6個のシスティン残基を有する力 /3 —ガラクトシド結合能はこの蛋白質が還元状態、即ちシスティンがフリ一の状態で有し、システィンが酸化された状態、即ち S S結合が形成された状態では^一ガラクトシド結合能を持たないことが分かつている。先に記述した特許出願公開や神経系に関する報告は全て還元状態におけるガレクチン- 1 が有するレクチンとしての存在や作用について記述したものである。しかし、この蛋白質が酸化した状態、即ち S S結合が形成され、レクチン活性が認められない状態での神経再生促進因子や生存維持因子としての神経系への生理作用についてはひとつの報告も存在しない。また、還元状態にあるガレクチン- 1 と酸化状態にあるガレクチン- 1 では上記の生物学的性質に加え、物理化学的性質も大きく異なる。酸化により SS 結合が形成されるということは、 2分子のシスティン残基から 1分子のシスチン残基となることであるから、蛋白質の分子量は 1組の SS 結合あたリ水素原子 2個分、即ち 2 ダルトン（Da) 小さくなる。ヒトガレクチン- 1 の場合は 3組の SS 結合が形成される可能性があり、その場合は 6 D a 小さくなることになる。その分子量の差は精度の高い質量分析計による分子量測定により判別可能である。また、 S S 結合により蛋白質の高次構造が大きく変わり、分子としての立体的な大きさや分子表面に存在するアミノ酸残基が変化するために SD S 存在下の電気泳動の移動度や、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ —等における溶出時間も変化する。ガレクチン- 1 が還元状態にあるのか酸化状態にあるのかを判別するためには、これらの物理化学的性質を調べることにより可能である。

神経障害では、神経組織の変性、脱落、神経軸索の切断、退行等が起こることから、予防 ' 治療に対しては、神経組織の変性や細胞死を抑制し、神経突起の再生を促進する作用を有する神経栄養因子類等が有効な治療薬として期待されている。 NGF、 CNTF、 BDNF 等の神経栄養因子類については医薬への適用に向けた研究が進められている。これらの神経栄養因子類は、主に発生段階の幼若な動物から単離された神経細胞を用いて、その神経再生促進作用や神経細胞の生存維持機能を有する因子として見つけられてきた。したがって、因子の作用発現のためには神経細胞に直接作用させる必要がある。しかし、成熟動物の神経細胞と発生段階の幼若な動物の神経細胞とでは因子に対する反応性も異なることがあるとともに、生体内で神経細胞は培養皿の中のように単独では存在しておらず、神経細胞は通常、神経細胞同士、神経細胞とシュワン細胞等の傍神経系細胞に囲まれた状態で存在、接触してお互いに情報交換して機能を維持している。神経損傷後の神経再生に際しても神経細胞を取り巻く他の細胞との間のクロストークを行って機能修復がはかられている。このために、神経細胞に直接作用する因子類を神経細胞にいかに作用させるか、即ち投与法の問題があり、神経障害治療薬としての開発が難航している。

このような状況の中で、本発明者らは、生体中で機能している構造をそのまま維持した神経組織の器官培養系を用いて、神経組織の神経線維切断端からの神経突起再生の促進及び生存維持活性を示す蛋白質性因子を見出すことによる別の角度からの新たな因子の発見、あるいは、物質としては既に知られている因子についての神経障害や損傷の治療薬としての新たな用途を見出すべく鋭意検討を行ってきた。

即ち、本発明の主たる目的は、神経損傷、神経変性、神経移植時機能低下を含む神経障害の治療に有効なガレクチン一 1又はその誘導体、並びに、それらを有効成分とする神経障害の治療剤を提供することである。発明の概要

本発明者らは、神経組織の神経線維の切断端からの神経突起再生を促進し、生存を維持する因子を得るべく、種々の検討を行った。インビボによリ近い評価方法として、成熟または老化ラットの後根神経節神経組織（DRG ) をコラーゲンゲル中に包埋し、その神経線維の切断端からの突起再生をみる器官培養アツセィ系を用いて因子の探索を行った。その結果、ラッド肝由来 cDNA を動物発現用べクタ一を用いてトランスフエクトした C0S 1 細胞培養上清から脊髄後根神経節線維の切断端からの突起再生を促進し、生存を維持する活性因子を精製し、部分配列を決定し、ガレクチン- 1配列を有する蛋白質と同定した。また、該ガレクチン一 1 をコードする DNA から発現した蛋白質がインビトロ、インビボで神経突起の再生を促進し、生存維持活性を示すことを見出した。

即ち、本発明は、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列を有するガレクチン一 1又はその誘導体を有効成分として含む、神経損傷、神経変性、神経移植時機能低下を含む神経障害の治療剤を提供する。

本発明で使用されるガレクチン— 1 又はその誘導体は、レクチン活性をもつものであってもよいし、或いは、レクチン活性をほとんど又は全くもたないものであってもよい。ここでレクチン活性とは /3 —ガラクトシド結合活性を指し、そのような活性をもつレクチンは通常ラクト一スカラム結合能又は赤血球凝集能を有している。

本発明の実施態様において、ガレクチン— 1 又はその誘導体は、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列中の 2 番目（Cys2) 、 16 番目（Cys l 6 )、 42番目（Cys42)、 60番目（Cys60)、 88番目（Cys88)及び 130番目（Cys 130) のシスティン残基のうち少なくとも 16 番目のシスティン（Cysl6)と 88 番目のシスティン（Cys88)の間でジスルフィド結合を形成している。

本明細書中「酸化型」とは、蛋白質の 2つ以上のシスティン残基がジスルフィド結合を形成した、いわゆる酸化状態にあることを意味する。本発明の蛋白質は、神経突起の再生、神経組織の修復等の神経再生促進作用をもつ。この意味では、本発明の蛋白質は神経栄養因子様の機能をもっといえる。従来公知のガレクチン一 1 は還元型でレクチン活性をもち神経細胞の接着基質として作用することが知られていた (N.K.Mahanthappa ら，上掲； A. C. Puch ら，上掲；など）が、本発明のようにガレクチン一 1 が神経再生促進因子として機能することは全く知られていなかった。

本発明の実施態様において、ガレクチン一 1 又はその誘導体は、配列番号 1 に示されるァミノ酸配列中以下の各システィン間にジスルフィド結合を形成しているものが例示される：

Cysl6-Cys88, Cys2-Cysl30及び Cys42-Cys60；又は

Cysl6-Cys88， Cys2-Cys60及び Cys42-Cysl30；又は

Cysl6-Cys88, Cys2-Cys42及び Cys60-Cysl30；

或いは、（1) 、（2) 及び（3) のうち少なくとも 2つの組の混合物、特に U) が 5 0 %以上含有する混合物。

誘導体としては、例えば以下のものが挙げられる：

(a) 配列番号 1 に示されるアミノ酸配列において 1 個以上、好ましくは 1 個若しくは数個、のアミノ酸が置換、欠失、揷入及び又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、神経再生促進作用を有するもの、或いは、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列を実質的に有するもの。ここで「実質的」とは、配列番号 1 に示すアミノ酸配列においてその蛋白質の神経再生促進活性に影響を与えない少なくとも 1個のアミノ酸の変更（置換、欠失、揷入及び Z又は付加）を含みうることを意味する。

(b) 配列番号 1 に示されるァミノ酸配列と比較してアミノ酸レベルで 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、さらに好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するもの。

( c ) N末端がァシル化（例えば、ホルミル化、ァセチル化など）されているもの。

(d) N末端に M e t— ^l L y s ²又は M e t ¹が付加されているもの。

( e ) 水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）又は炭水化物鎖と共有結合されているもの。

本発明の治療剤は、事故による外傷や外科手術等よる中枢及び末梢の神経損傷時の神経再生促進、機能回復；ガンやエイズ等の疾病に対する化学療法や放射線療法等の治療的措置による神経の損傷によってもたらされた障害；薬剤や重金属、アルコール等の化学物質による中枢及び末梢の神経損傷による神経障害；虚血ゃ感染、悪性腫瘍や代謝異常、例えば糖尿病性神経障害や腎臓や肝臓等の機能異常等による神経損傷；特定の神経系細胞の変性、例えば、運動神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症やアルツハイマー病等の神経変性疾患；などの神経障害の治療に有用である。また、本発明の治療剤は、神経移植による機能低下等の神経障害の回復治療の際に神経再生促進剤として用いることもできる。

本発明の治療剤は、医薬的に許容される液体又は固体の担体と組合わせて、経口、非経口等の医薬形態とし得る。また、この治療剤には、本発明の蛋白質に加えて、 NGF (神経成長因子）、 BDNF (脳由来神経成長因子）等の他の 1 つ以上の神経栄養活性を有する因子、或いはこのような因子を含む細胞外マトリックスまたは傍神経細胞が含有されてもよい。本発明の実施態様において、本発明の治療剤は、本発明の蛋白質をコラーゲンゲル中に含有させ、必要に応じて他の神経栄養因子を添加し、神経障害局部に直接埋め込む形態のものであってもよい。この場合、薬剤、担体等の必要な成分を生体適合性材料（例えば、シリコンゴム、コラーゲン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミドなど）からなるチューブ内に封入される。あるいは、本発明は、本発明の上記治療剤を、神経損傷、神経変性、神経移植時機能低下等の神経障害に対する治療を必要とする患者（ヒトを含む）に投与することを含む該神経障害を治療する方法にも関する。本発明はまた、上記定義のガレクチン一 1又はその誘導体を提供する。本発明はさらに、上記定義のガレクチン— 1 又はその誘導体を含有する物質（例えば、天然或いは組換え法又は化学的方法から得られた物質）を、上記蛋白質に対する抗体を結合したァフィ二ティーカラムに通して上記蛋白質を吸着し、次いでそれらを溶出し、必要に応じてさらに酸化処理にかけることを含む、上記蛋白質を製造する方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、ラットの各組織からの RNA に関するノーザンブロットアツセィの結果を示す電気泳動の写真である。

図 2は、 pRLF 導入 C0S 1 細胞の培養上清から精製された神経再生促進因子の電気泳動像を示す写真である。

図 3は、 pRLF 導入 C0S 1 細胞の培養上清から精製された神経再生促進因子をリシルェンドぺプチダーゼで消化後、逆相カラムクロマトグラフィ一により決定されたべプチドマツプを示す。

図 4は、大腸菌発現 Gal l ( 1 — 134) の神経再生促進活性の結果を示す。ここで、中枢端および末梢端はそれぞれ中枢神経切断端、末梢神経切断端を示す。

図 5は、大腸菌発現産物 Ga l l ( 1 一 134) をトリプシンで消化後、逆相カラムクロマトグラフィーにより決定されたペプチドマップを示す。図 6は、大腸菌発現産物 Ga l l ( 1 - 134) のトリプシン消化後のフラグメント T P 9のリシルェンドぺプチダ一ゼによる 2次消化産物の逆相カラムクロマトグラフィーにより決定されたべプチドマップを示す。図 7は、大腸菌発現 Ga l l ( 1 — 134) の赤血球凝集活性測定の結果を示す。

図 8は、 Gall( l- 134) ( A ) とコントロール（ B ) を連続投与 1 4 日間の後の坐滅端から 6 mm末梢の部位の電子顕微鏡観察像を示す生物形態の写真である。

図 9は、 Gall(l-134) (A) とコントロール（ B ) 投与の術後 1 0 日目灌流固定後、 longitudinal 凍結切片の H E染色像を示す生物形態の写真である。

図 10 は、 Gall(l-134) (A) とコントロール（ B ) 投与の術後 1 0日目灌流固定後、 longitudinal 凍結切片の抗 N F抗体による免疫染色像を示す生物形態の写真である。発明の詳細な説明

以下に、本発明の神経再生促進活性を有する蛋白質（以下、「本発明の蛋白質」と言う）の製造方法および該蛋白質を含む医薬組成物について説明する。遗伝子構築

本発明の蛋白質は、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列の全部又は一部をコードする DNA、或いは、該アミノ酸配列の誘導体（例えば 1個以上のァミノ酸が置換、欠失、挿入及びノ又は付加されたァミノ酸配列）をコードする DNA を含む組換えべクタ一を構築し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた宿主細胞を培養し、目的の蛋白質を分離，精製して得ることができる。

本発明の蛋白質をコードする DNAは、ゲノム DNAの制限酵素切断、 cDNA ライブラリーからのクローニング、または DNA合成にょリ、またはこれによリ得られた DNA をオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法ゃカセット変異法等の部位特異的突然変異技術や PCR法を用いて改変、増幅することにより、得ることができる。この場合、例えば、 Molecular Cloning[Sambrook ら， Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ]に記載の技術を使用することができる。

本発明の蛋白質の遺伝子及びその構造については、ヒト、マウスを含む種々の生物のものについて既に知られている（例えば、 AbboU et al., Biochem. J. , 259, 291-294, 1989や Ch i ar i oU i e t a 1.， Biochim. Biophys. Acta, 1089, 54-60, 1991 ) ので、これら公知の塩基配列やアミノ酸配列情報に基づき、 cDNA ライブラリ一から PCR 法や DNA 合成技術等を用いて本発明の蛋白質をコードする DNA を適宜取得作製することができる。

cDNA ライブラリーから取得する方法については、例えば後述の実施例に示されるように、ヒト肝臓組織から慣用の手法により cDNA ライブラリ一を作製し、既に知られているヒトガレクチン一 1 の塩基配列に基づき作製したブライマーを用いた PCR法により、本発明の蛋白質をコ一ドする cDNAを取得することができる。

DNA 化学合成により取得する場合には、例えばアルトンらの方法（特表昭 59-501097 号公報）によって、本発明の蛋白質のアミノ酸配列に基づき、必要であれば優先コドンの使用も考慮して、塩基配列をデザインし、本発明の蛋白質をコードする DNA断片を得ることができる。

また、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、付加、揷入及び又は置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドについても、上述したガレクチン- 1 をコードする DNA を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法等の部位特異的突然変異技術（例えば、 Mark et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 81， 5662 - 5666, 1984, Inouye et al. , Pro atl. Acad. Sci. USA, 79, 3438-3441, 1982, PCT W085/00817, 1985年 2月 28 日公開， Wharton et al. , Nature, 316, 601-605, 1985) や PCR 法を用いて、また DNA の化学合成により、そのような変異体ポリペプチドをコードする DNA を作製することができる。

宿主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例としては、 C O S細胞、チャイニーズハムスター卵巣 (Chinese Hamster Ovary ) 細胞、 X63.6.5.3. 細胞、 C - 127 細胞、 B H K (Baby Hamster Kidney ) 細胞、ヒト由来細胞（例えば、 HeLa 細胞）等があげられる。酵母の例としては、パン酵母 ( Saccliaromyces cerevisiae) やメタノール資化性酵母 Pichia pastoris ) 等があげられる。昆虫細胞の例としては、蚕培養細胞（例えば、 Sf21 細胞）等があげられる。

原核又は真核細胞を用いて本発明の蛋白質を製造する場合には、該蛋白質をコードする DNA に、制限酵素による切断部位の付与、および Zまたは、発現を容易にするようなプロモーター等の DNAを付加したものを、適切な発現べクタ一に組み込み、該ベクタ一で形質転換またはトランスフエクトされた細胞を培養し、産生された本発明の蛋白質を分離 · 精製することによって得ることができる。宿主として大腸菌を選択する場合には、大腸菌における発現に好ましいコドン（優先コドン）を組み込んでもよい。

大腸菌を形質転換するために用いられるベクターには、 PKC30 (Shimatake H. and M. Rosenberg, Nature, 292， pl28-132, 1981) 、 pTrc99A (Amann E. et al, Gene, 108, 193-200， 1991) 、 pCFM536 (ATCC No. 39934、特表昭 60— 501988号参照）等が挙げられる。

哺乳動物細胞用のベクタ一としては、 pSV2-neo (Southern and Berg, J. Mol. Ap l. Genet. , 1, 327-341, 1982) 、 pCAGGS (Niwa et aし， Gene, 108, 193-200， 1991) 、又は pcDL-SR a 296 (Takebe et al. , Mol. Cell. Bioし， 8， 466-472, 1988) 等がある。酵母用としては pG- 1 (Schena M. and Yamamoto K. R. , Science, 241， 965-967, 1988) 等がある。蚕細胞用としては、組み換えゥィルス作製用トランスファ一ベクタ一 pAc373 (Luckow et al. , Bio/Technology, 6, 47-55， 1988) 等がある。

これらのベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカ一、プロモーター、リボソーム結合部位を含んでもよく、真核細胞用のベクターにはさらに、必要に応じて R NAスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。

複製起点として、哺乳動物細胞用ベクターには、 SV40、アデノウィルス、ゥシパピローマウィルス由来のもの等を用いることができる。大腸菌用ベクタ一としては、 ColEl、 R 因子、 F 因子由来のもの等を用いることができる。酵母用としては 2 μ raDNA、 ARS1 由来のもの等を用いることができる。

遺伝子発現用プロモーターとしては、哺乳動物細胞用べクタ一には、ウィルス由来であるレトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウィルス、 SV40 由来のもの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、 EF1- ) 等を用いることができる。大腸菌用ベクターには、パクテリオファ —ジ λ由来のものや、 trp、 lpp、 lac、 iac プロモータ一等を用いることができる。パン酵母用としては ADH、 PH05、 GPD、 PGK、又は MAF α プロモータ一を、また、メタノール資化性酵母については A0X1 プロモータ一等を用いることができる。蚕細胞用べクタ一には核多角体病ウイルス由来のもの等を用いることができる。

選択マーカ一として、哺乳動物細胞用ベクターには、ネオマイシン (neo ) 耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（TK) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR) 遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ（Ecogpt) 遺伝子等を用いることができる。大腸菌用べクタ一には、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。酵母用としては Leu2、 7>pl、〃ra3遺伝子等を用いることができる。

例えば、配列番号 1 に示されたアミノ酸配列 1〜134 位からなる本発明の蛋白質を製造する場合、 1〜134位のアミノ酸配列をコードする DNA を合成し、その N 末端に Ncol サイト（翻訳開始コドンの ATG を含む）を付加し、また C末端には stop コドンとその下流に BamHI サイトを付加する。この DNA 断片を、 Nco I 、 BamHI で処理し、 Nco I 、 BaraHI で消化した pET— 3d (ストラタジーン社製）にクローニングし、 Epicurian

Coli BL2KDE3) Competent Cells (ストラタジーン社製）を使用し、発現ベクターを有する大腸菌株を本発明の蛋白質発現用の形質転換体とする。発現プラスミド pET— 3d 中で目的遺伝子は T7 ファージプロモーター下流に揷入され、宿主大腸菌より供給される T7 RNA ポリメラ一ゼにより転写される。この T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子は、宿主大腸菌染色体に組み込まれており、 UV5 プロモーター下流にあるため、 I PTG 添加による誘導で発現をコントロールできる。蛋白発現、リフォ一ルディング、精製

以上の様な宿主—ベクター系を用いて本発明の蛋白質を得るためには、上記ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組み換え DNA体によリ、宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養し、さらに細胞内あるいは培養液から該ポリペプチドを分離 · 精製すればよい。これらに用いられる手段 · 方法は公知のものを組み合わせて行なうことができる。

宿主を用いて発現させる場合に、その発現産物の N末端をよリ確実に均一化するため、本来のシグナル配列を改変したり、他の蛋白質のシグナル配列を用いてもよい。また、 N末端およびその近傍のアミノ酸残基を改変（置換、または付加）すること（例えば、大腸菌を用いて発現させる場合にメチォニン残基の他に、アルギニンまたはリジン残基を付加するなど）によっても、 N末端を均一化することが可能である。

また、本発明の蛋白質の N末端あるいは C末端にダルタチオン- S - トランスフェラーゼ（ G S T ： G l utath i one-S-t rans fe ras e ) 、ヒスチジンタグ、あるいは FLAG ベプチド等を特異的酵素（例えばトロンビン、 Facto r X a、ェンテロカイネースなど）の認識べプチドを介して付加し、融合蛋白質として適当な宿主にて発現させ、単離した後、その融合蛋白質を該当する酵素により処理することにより、本発明の蛋白質を得ることができる。

本発明の蛋白質としては、配列番号 1 に示されたアミノ酸配列から成る蛋白質がある。また、本発明には、神経再生促進活性を保持する限り、その一部のアミノ酸配列が改変（置換、欠失、挿入および Zまたは付加）されたもの、即ち本発明の蛋白質誘導体も含まれる。本発明の蛋白質誘導体の例としては、例えば、アミノ酸の改変（置換、欠失、挿入および Zまたは付加）、 N末端のァシル化、 α—アミノ基若しくは ε —アミノ基へのポリエチレングリコール等水溶性ポリマーの結合などによって安定性や体内での持続性の向上、免疫原性の低下を図ることができる。

一般に蛋白質の熱力学的安定性を向上させる方法として、プロリン残基の導入とグリシン残基の除去が有効であることが理論的に示されている (Matthews ら， Pro atl. Acad. Sci. U.S.A. 84， 6663-6667, 1987 ) 。そこで、安定性の向上を目的とした本発明の蛋白質誘導体を設計する場合、プロリン残基を導入した本発明の蛋白質誘導体およびダリシン残基を除去した本発明の蛋白質誘導体を考えることができる。

また、一般に蛋白質は、疎水性アミノ酸を内側に、親水性アミノ酸を外側に立体構造が形成されることから、蛋白質表面に存在するアミノ酸をよリ親水性の高い荷電性アミノ酸に置換することによって蛋白質の溶解性の向上を期待することができる。本発明の蛋白質の場合でも、このような観点から誘導体を設計することができる。

さらに、相同性を有する他の生物種由来のガレクチン - 1 (ニヮトリガレクチン： 0hyama,Y. ら、 Biochem. Biophys. Res. Commum. 134 巻、 51-56 頁、（1986)、ラットガレクチン： Clerch, L. B.ら、 Biochemistry 27巻、 692-699頁、（1988)、マウスガレクチン： Wi 1 son, T. J. G.ら、 Biochem.J. 261巻、 847-852頁、（1989)、ゥシガレクチン： Abbot，W.M.ら、 Biochem, J. 259 巻、 283-290頁、（1989)，等）のアミノ酸配列を利用することができる。例えば、ヒト型とラット型のアミノ酸配列を比較し、ヒト型ではプ口リンではないがラット型ではプロリンを有する部位、あるいは、ヒト型ではダリシンだがラット型ではダリシン以外のァミノ酸を有する部位を選ぶことができる。

また、本発明の蛋白質としては、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列を有するヒト型の本発明の蛋白質、および前述の誘導体の— 2位にメチォニン残基、かつ— 1位にリジン残基.が付加された蛋白質、ー 1位にメチォニン残基が付加された蛋白質も含まれる。宿主として細菌（例えば、大腸菌）を用いて菌体内発現を行う場合には、神経再生促進活性を有する蛋白質の N末端側に開始メチォニン残基の付加された蛋白質が得られる場合もあることが知られている。また、用いる宿主によっては、産生される神経再生促進活性を有する蛋白質はダリコシル化されている場合や N 末端がァセチル基、ホルミル基等によリブロックされている場合もあるし、あるいはされていない場合もあるがいずれも、本発明の蛋白質に含まれる。

本発明の蛋白質は、天然の供給源（例えば、神経再生促進活性を含むならし培地、またはヒト肺、腎臓、胎盤等）から精製および単離されたものでもよいが、好ましくは遺伝子組換え法によって得られたものである。後者の場合、大量生産が可能であるという利点がある。

天然源や組換え細胞から本発明の蛋白質を精製する場合、一般に蛋白質の精製に用いられる手法、例えば塩析、硫安分画、溶媒抽出、 HPLC、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンァフィ二ティ一クロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィ一、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ ―、逆相クロマトグラフィー、へパリンァフィ二ティーク口マトグラフィ一、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ハイド口キシルアパタイトクロマトグラフィ一、金属キレ一ティングクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法など、の一つ以上を組み合わせて行うことができる。また、後述の実施例から推定しうる本発明の蛋白質の物理化学的な性質を利用することもできる。さらには、本発明の蛋白質を認識することのできる抗体を用いた抗体カラムを用いることもできる。

本発明の蛋白質のアミノ酸配列中には 6個のシスティン残基が含まれるが、その存在様式はジスルフイド結合で架橋されていること（酸化されていること）が望ましい。還元型蛋白質を酸化型蛋白質に変換する酸化方法としては化学的酸化法あるいはジスルフィド交換反応を利用することができる。化学的酸化法としては空気酸化法、重金属イオン（例えば Cu² を触媒として用いる空気酸化法、ョードソ安息香酸や過酸化水素を用いる方法等を利用できる。また、ジスルフイド交換反応としては還元型ダルタチオンと酸化型ダルタチオンを含む酸化還元緩衝液を用いる方法が代表的であるが、システィンゃジチオスレィトール、 2-メルカブトエタノール、システアミンをベースにした酸化還元緩衝液を用いる方法も利用できる。これによつて、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列中の 2番目（Cys2)、 16番目（Cysl6)、 42番目（Cys42)、 60番目（Cys60)、 88番目（Cys88)及び 130 番目（Cys 130)のシスティン残基のうち少なくとも 16番目のシスティン（Cysl6)と 88番目のシスティン（Cys88)の間でジスルフィド結合を形成している本発明の蛋白質を得ることができる。蛋白質中、ジスルフイド結合は 1 個以上 3個以下、好ましくは 2〜3個、さらに好ましくは 3個である。配列番号 1 に示されるァミノ酸配列をコードする DNA を大腸菌で発現させリフォ一ルディング操作を行った場合には、以下の各システィン間にジスルフイド結合を有する（1) Cysl6- Cys88, Cys2-Cysl30 及び Cys42-Cys60; (2) Cys 16 - Cys88， Cys2 - Cys60 及び Cys42-Cysl30； (3) Cys 16- Cys88, Cys2-Cys42 及び Cys60-Cysl30 の 3種類の酸化型ガレクチン一 1 からなリ、（ 1 )のガレクチン一 1 を 50% 以上含む混合物として得られる。また、該 DNA を C0S1 細胞で発現させた場合には、（ 1 ) の酸化型ガレクチン一 1 が主として得られる。カラムとして YMC P r o t e i n R P (内径 l O mm X長さ 2 5 0 mm， YMC社製）を用いて、室温にて 0. 1 % T F A中でァセトニトリルの濃度を 6 0分間で 3 2 %〜 4 0 %までの直線的に上昇させる高速逆相ク口マトグラフィ一によつて、大腸菌発現の酸化型ガレクチン一 1 は、（ 1) のフォームが約 3 6 %ァセトニトリル濃度、（2) 、（3) のフォームが約 3 4 %ァセトニトリル濃度で溶出される。 C O S 1 細胞発現の（1) のフォームは、カラムとして YMC P r o t e i n R P (内径 4. 6 mm x長さ 1 5 0 mm， YM C社製）を用いて、室温にて 0. 1 %T F A中でァセトニトリルの濃度を 4 5分間で 3 2 %から 4 4 %までの直線的に上昇させる高速逆相クロマトグラフィ一によって、約 3 8 %ァセト二トリル濃度で溶出される。医薬組成物

本発明には、上記定義のガレクチン一 1又はその誘導体を有効成分として含む、神経損傷、神経変性、神経移植時機能低下、等の神経障害の治療剤も包含される。

治療剤には、一般的な適当な液体または固体担体の他に、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、？し化剤、アジュバントが含有されてもよい（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company, 1995 参照）。このような組成物は、液体または固体からなる形態であって、種々の pH およびイオン強度から成る緩衝剤（例えばトリス- 塩酸、酢酸塩、リン酸塩）よリ選択した希釈剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えば Tween 20、 Tween 80、 Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えばァスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトール）を配合し得る。

また、蛋白質に対するポリエチレンダリコールのような水溶性ポリマ一との共有結合、金属イオンとの錯体化、あるいはポリ乳酸、ポリダリコール酸、ヒドロゲルなどのような重合化合物の粒状製剤中またはその表面上への、あるいはリボソーム、ミクロエマルジヨン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフエロプラスト中への該物質の取り込みを包含する。このような組成物は、本発明の蛋白質の物理的状態、溶解性、安定性、インビボ放出速度、インビボクリアランスに影響を及ぼすと思われるので、組成物の選択は、神経再生促進活性を有する蛋白質の物理的および化学的特性による。

本発明の治療剤は、非経口、経肺、経鼻、経口、局部埋め込みを含めた種々の投与経路が可能であり、投与経路に応じて粒状形態、保護被膜、プロテア一ゼ阻害剤の配合、吸収促進剤の配合、コラーゲンなどの生体材料または生体適合材料への包接、等とすることができる。剤型としては、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、エアゾル剤、腸溶剤、徐放製剤、埋め込み型製剤などであるが、これらに制限されない。本発明の実施態様において、本発明の蛋白質をコラーゲンゲル中に含有させ神経障害局部に直接埋め込む形態のものであってもよいが、例えば、薬剤、担体等の必要な成分を生体適合性材料（例えば、シリコンゴム、コラーゲン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミドなど）からなるチューブ内に封入し得る。

本発明の蛋白質を含有する治療剤は、活性成分として通常 0. 0 1 μ gZk g体重〜 1 mgZk _g体重を、年齢、体重、病状、性別、投与経路等に応じて、一日 1 回〜数回程度投与することができる。しかし、投与量はこの範囲に限定されず、治療上の種々の要因によつて変動させ得る。

本発明の蛋白質は、単独あるいは他の付加的神経栄養活性を有する因子類と組み合わせても、多数の神経系障害の治療に有用である。他の付加的因子としては、 NGF、 BDNF、 NT-3、 NT- 4/5、 NT-6 等のニューロト口フィンファミリ一やインスリン、 IGF- I、 IGF- Π等のインスリンファミリ一、 aFGF、 bFGF、 FGF-5 等の FGF ファミリ一、 IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-6等のインターロイキン類や LIF、 GM-CSF, G-CSF、 EP0、 TP0、 CNTF、オンコスタチン（oncostatin) M、 TNF α、チォレドキシン、 GDNF、 TGF EGF、成長促進活性（growth promoting activity) 、成長抑制因子

( growth inhibitory factor; 、フラスミノーケン (plasminogen) 、グリア由来ネキシン（ g 1 i a-de r i ved nex i n ) 、 a ₂ マクログロブリン

(macroglobulin) 、 S100 蛋白質、ァネキシン（annexin) V、神経特異的エノラ一セ ( neuron specific eno 1 ase ) 、卜ロンホスホンシン

(thrombospondin) 、肝細胞成長因子 ( hepatocyte growth factor) を挙げることができる。更に GM 1、 GM2 等のガングリオシドゃアデノコルチコトロピン； ;ノレモン ( adrenocorticotropic hormone (ATCH) ) 、チロトロピン放出ホルモン（ thyrotropin-releasing hormon (TRH) ) 、海馬コリン作動性神経栄養ペプチド（ hippocampal cholinergic neurotrophic peptide (HCNP) ) 、コルチコトロピン放出ホルモン (corticotropin-releasing hormon (CRF)) 等の神経ペプチドを挙げることができる。望ましくは、 NGF、 BDNF、 NT- 3、 NT- 4/5、 NT- 6、 IGF- I、 IGF-n、 CNTF、 GDNFを挙げることができる。

また、本発明の蛋白質は、細胞外マトリックスや傍神経系細胞と組み合わせても神経系障害の治療に有用である。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、フイブロネクチン、スロンボスポンディン、コラーゲン等が挙げられる。傍神経系細胞としては、シュワン細胞、線維芽細胞、サテライト細胞、マクロファージ、グリア細胞等が挙げられる。また、傍神経系細胞の基底膜との組み合わせも神経障害治療に有用である。本発明の蛋白質は、インビトロ及びインビボでの試験によって、神経の切断、坐滅、凍結等による損傷からの神経突起の再生、再有髄化を促進することが示された。神経線維をともなつた脊髄後根神経節をコラーゲンゲル中に包埋しその神経線維切断端からの神経突起再生効果を調べる系 (Horie H. et al, eurosci Lett 121, 125-128(1991), Horie H. et al.NeuroReport 2, 521-524 (1991)) によって、明らかな神経突起再生効果を示した。更にンビボにおいても、坐骨神経の切断や坐 ¾、凍結による神経損傷からの神経再生効果を示した。先に報告されている方法 ( S. Varon, et al, plOl-122 in "Frontiers of clinical neurosc i ence, vol.6 Γ Neural Regeneration and Transplantation J " edited by F. J.SeiKAlan R Liss, Inc. ) ( 1989)， G. Lundborg, et al, Exp. Neurol. , 76, 361-375(1982), LR Williams, et al, J. Comp. Neurol. , 218， 460-470 (1983), Q.Zao, et al, estor. Neurol. Neurosci. , 5, 197-204( 1993)) を参考にして、坐骨神経切断端へシリコンチャンバ一を装着し、チャンパ一内への神経突起の再生を調べる実験を行った結果、本発明の蛋白質はコラーゲンゲルを充填したチャンバ一内への神経突起再生を促進する効果を示した。また、坐骨神経を坐滅及び凍結による損傷を与えた後の神経再生過程を損傷部の電子顕微鏡による観察実験 ( A Se to , Has egawa M, Uch i yama N, Yamash i ma T, Yamash i t a J : J Neu ropatho l Exp Neu ro l 56 : 1 182- 1 190 ( 1997 ) ) を行った結果、本発明の蛋白質の投与によって神経突起再生及び再有髄化が促進されることが明らかとなった。本発明のこれらの実験による神経再生促進効果から、本発明の蛋白質は神経突起の退縮や脱髄を伴う様々な神経損傷や神経変性疾患等の神経障害の治療に有用であると考えられる。

本発明の蛋白質の用途としては、事故による外傷や外科手術等よる中枢及び末梢の神経損傷時の神経再生促進、機能回復に有用である。また、ガンやエイズ等の疾病に対する化学療法や放射線療法等の治療的措置による神経の損傷によってもたらされた障害の処置である。また、薬剤や重金属、アルコール等の化学物質による中枢及び末梢の神経損傷による神経障害に投与することができる。神経障害はまた、虚血ゃ感染、悪性腫瘍や代謝異常、例えば糖尿病性神経障害や腎臓や肝臓等の機能異常等、による神経損傷によっても起こる。更に、神経障害は、特定の神経系細胞の変性、例えば、運動神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症やアルッハイマー病等の神経変性疾患、によっても起こる。本発明の蛋白質は、上に示したような神経の損傷や変性による神経障害の処置に用いることができる。また、神経損傷時の末梢神経の移植時や人工神経移植時の患者に投与することができる。また、本発明の蛋白質の産生異常による神経機能障害にも有用である。

本発明はさらに、抗体カラムを用いて本発明の蛋白質を製造する方法を提供する。抗体カラムは、本発明の蛋白質と交差反応する抗体をカラムの支持体に結合することによって得られる。この場合、蛋白質全体または抗原決定基を有するその断片が抗原として使い得る。抗体は、モノクローナルおよびポリクロ一ナル抗体の双方、および既知の方法によつて作製したキメラ抗体、即ち "組換え" 抗体などを含む。種々の抗原決定基（ェピトープ）に対する種々の抗体を一般に含有する慣用的抗体（ポリクローナル）であるのに対して、モノクローナル抗体は各々、抗原上の単一抗原決定基に対する抗体である。

ポリクローナル抗体については、本発明の蛋白質を F reund の完全ァジュバントに乳濁させてゥサギ、マウス、ラット、モルモット、ヒッジなどの動物に免疫し、さらに Freund の不完全アジュバントを用いて 1 週間おきにブーストし、放血にょリ抗血清を得ることができる。必要に応じて、抗血清を例えば硫安分画にかけて I gG を粗精製し、さらに、この粗精製物を、精製蛋白質を結合したァフィ二ティ一カラム（例えば、 CNBr 活性化 Sepharos e 使用）に通す吸収操作によって本発明蛋白質に対する特異抗体を得ることができる。

モノクローナル抗体の利点は、それらが、他の免疫グロブリンが混入していない培地中でハイプリドーマ細胞によって合成され得ることである。モノクローナル抗体は、ハイプリドーマ細胞の培養上清から、またはマウスにハイプリドーマ細胞を腹腔内接種することによって誘導される腹水から調製される。 Koh l e r と M i l s te i n が最初に記載したハイプリドーマ技術（Eur . J . Immuno l . 6、 51 1 -519 ( 1976 ) ) は、多数の特異抗原に対する高レベルのモノク口一ナル抗体を保有するハイプリッド細胞系を生成するために広く用い得る。モノク口一ナル抗体は次のようにじて調製することができる。本発明の蛋白質—を死菌体等のアジュバントと共にマウス（例えば、 BALB/c ) に腹腔内注射により免疫し、追加免疫の後、抗体の産生を確認してマウスから脾臓を摘出する。脾細胞を調製し、ポリエチレングリコール（例えば、 # 4000) の存在下に HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有）培地中、速やかにミエ口一マ細胞株（例えば、 X63、 NS- 1 など）と融合する。ハイプリドーマの HAT 選択、特異抗体産生細胞のスクリーニングの後、この特異抗体産生細胞をマウスの腹腔に接種してクローン化し、モノクローナル抗体を得る。モノクローナル抗体の作製法の詳細については、例えば、岩崎辰夫ら共著、「単クローン抗体一ハイブリド一マと EL i SA」 ( 1987 ) 講談社サイェンティフイク、東京、日本国に記載されている。 ' 上記のようにして得られた抗体は、臭化シアンで活性化した Sepharose (フアルマシア社製）などのァガロースゲル等のゲルに結合して抗体力ラムを作製し、このカラムに天然源（例えば、神経再生促進活性を含むならし培地、またはヒト肺、腎臓、胎盤等）、組換細胞または培養物などに由来する液体を流して吸着させ、塩濃度勾配、 p H変化、変性剤を用いて溶出することによって、本発明の蛋白質を分離 ' 精製することができる。

本発明の蛋白質含有治療剤を安定化するために、糖類、界面活性剤等の安定化剤を添加し得るが、例えば以下のものが挙げられる。

糖類としては、マンニトール、ラクト一ス、シュクロース、マルト一ス、グルコース、イノシトール、キシロース、ソルビトール、フルクトース、ガラクト一ス、リボース、マンノース、セロビオース、シクロデキストリンなどが利用できる。これらの中でもソルビトール、マンニトール、シュクロースが好ましい。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリソルべ一ト 8 0やモノラウリン酸ポリオキシェチレンソルビタン（別名：ポリソルベート 2 0 ) などのポリオキシェチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリォキシエチレンポリォキシプロピレングリコール、モノォレイン酸ソルビタンなどのソルビタン脂肪酸ェステル、ショ糖モノラゥリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、塩化ベンゼトニゥム、塩化ベンザルコニゥムなどの芳香族四級アンモニゥム塩、力プリル酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどが利用できる。この中でも、ポリソルベート 8 0やポリソルベート 2 0、ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油が好ましい。

本発明において用いられるこれらの糖類、界面活性剤は、本発明の蛋白質含有治療剤中、糖類の場合には 0 . 1 〜 5 0 % ( W/V ) 、界面活性剤の場合には 0 . 0 0 0 1 〜 5 0 % ( w/v ) の範囲で使用され得る。本発明の蛋白質含有治療剤としては、上述の神経栄養活性を有する種々の蛋白質のみならず、該蛋白質が少なくとも一つの水溶性ポリマ一に結合している化学修飾した本発明の蛋白質も含まれる。水溶性ポリマ —は、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ一ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（ N—ビニルピ口リドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマ一、ポリプロピレンォキシド /エチレンォキシドコポリマ一、ポリビニルアルコールなどから選択される。これらのポリマーは、蛋白質の N末端の一アミノ基ゃリシンの ε —ァミノ基とアルデヒドのような反応性基を介して共有結合することができる。特に本発明の蛋白質は反応性ポリエチレングリコール (PEG) 分子と反応して、 PEG を本発明の蛋白質に付加させたものが好ましい。また、 PEGの分子量は 6 k Da〜 50k Daのものが好ましい。

本発明の蛋白質は、上記および下記で説明するように、神経突起の再生及び神経組織の修復を促進し且つ生存維持を促進する、神経障害時の神経再生促進剤として有用である。実施例

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によつて限定されるものではない。

以下の実施例において、末梢神経再生のィンビト口評価を次のようにして行った。

神経線維を伴った脊髄後根神経節（DRG: Dorsal Root Ganglion)を動物より摘出し、コラーゲンゲル内で培養した系をインビトロモデルとして用いる。この系を用いた因子の神経再生促進、生存維持活性の測定は以前に発表した論文（H.Horie et al， euroReport, 8， 1955-1959, 1997) の記載に従って実施した。 3 ヶ月齢の Wis tar ラットより l 〜 2 mmの長さの神経線維束を伴った T 2〜T 1 1 の DRG を摘出した。この DRG を氷上（0°C) におかれた培養デイシュ上のコラーゲン溶液（希酢酸溶液に溶解した 0.5 コラーゲン（タイプ I) 溶液（ A) 、 1 0倍濃縮最小必須培地（MEM) ( B ) 、 2.2gNaHC0₃ と 4.77gHEPES を 0.05NNaOH に溶解し 100ml とした溶液（ C ) を A : B : C = 8 : 1 : 1 (容量）の割合で混合した溶液）中に置いた。このデイシュを 37°Cに直ちに加温し 5分間保温してコラ一ゲン溶液をゲル化させた。その後デイシュに 5 g/ml ィンシュリン、 5 μ g/ml トランスフェリン、 20nM プロゲステロン、 30nM 亜セレン酸ナトリウム、 0. ImM プトレシンを含む Ham's F 12培地を満たし、 5%C0₂含有水蒸気飽和大気中 37°Cで培養した。

培地中に種々の濃度の神経再生促進因子や精製途中の分画画分を加え、 6〜 7 日培養した後、神経線維切断端からの再生神経突起数を位相差頭微鏡下で測定した。各 DRG について末梢側と中枢側の神経線維切断端のそれぞれの再生神経突起数を測定し、測定した全 DRG よりそれぞれの平均値並びに標準誤差値を算出し、活性の優位性を統計的に評価した。実施例 1

ラット初代培養肝細胞からの mRNAの精製

堀江らによってラット初代培養肝細胞の培養上清中に神経再生促進活性が見い出された（Horie H. et al.， Neuroreport, 2, 521-524, 1991) ことから、ラット初代培養肝細胞をラット神経再生促進因子の c DNA クローニングの材料に選び以下の実験に供した。

全 RNA の抽出は IS0GEN [二ツボンジーン社製； AGPC法（ Chomczynski P, et al.， Anal. Biochem. 162， 156-159， 1987) による RNA抽出試薬] を用いて行った。ラット初代肝細胞の調製は、酵素灌流法（中村敏ー著、初代培養肝細胞実験法、 1987 年、学会出版センター、東京、日本国）を用いて行い、培養はコラーゲンコートした培養フラスコ中で W i 11 i am' s E液に 5 g/ml インスリン（シグマ社製）、 0.01 g/ml EGF (東洋紡社製、日本国）、

ァプロチニン（シグマ社製）を加えた無血清培養液中で行った。 8週齢のラットの肝臓から調製した初代培養細胞を 25枚の 175cm²培養フラスコ（ファルコン社製）に一枚当たり 8X 10⁶ 個撒き、 5 % 炭酸ガス培養器中にて 37°Cで 2 日間培養した後、フラスコから培養液を除き、 1枚当り 4ml の IS0GEN 溶液を加え、よく懸濁した後混合液を集めた。この全量 100ml の混合液は、 22G の注射針を装填した 50ml 容の注射器を用い、粘性がほとんどなくなるまでおよそ 20回吸入排出を繰り返した。混合液に 20ml のクロ口ホルムを加え、混合した後、 12，000G で 15 分間遠心した。上清を注意深く他のチューブに移し、 50ml のイソプロピルアルコールを加えて混合し、 12，000G で 10 分間遠心した。得られたペレットは少量の 70%エタノールを用いて 1 回洗浄した。これにより、約 2X 10⁸個の肝細胞より全 RNA 約 2mg を得た。全 RNA からのポリ（A)⁺ RNA の精製は mRNA Purification Kit (フアルマシア社製；オリゴ d Tセルロースを用いた方法）を用いて行った。全 RNA 約 2mgより 90 g のポリ（A)+ RNA を得た。実施例 2

発現クローニング用ラット初代培養肝細胞由来 cDNA ライブラリーの構 H.

実施例 1 で得られたのポリ（A)+ RNA から TimeSaver^TMcDNA Synthesis Kit [ファノレマシァ社製； Gubler & Hoffman 法 (Gene 25， 263-269, 1983 ) の変法による c D N A合成法のキット ] および DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX [フアルマシア社製； Notl 配列を含む c D N A 合成のためのプライマ一： 5 ' - AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T) ₁₈ - 3' (配列番号 11) 並びに EcoRI配列付加用アダプタ一： 5' -AATTCGGCACGAGG-3' (配列番号 12) および 5' -CCTCGTGCCG-3' のセット ] を用いて、 Met 側に EcoRI 、ポリ（A)側に Notl認識部位を持つ 2本鎖 cDNAを合成した。合成した cDNAの 2/3は 1.5 g の予め EcoRI および Notl で消化した発現べクタ一 p E F 1 8 S (Ohashi H.， et al. , Pro atl. Acad. Sci. USA 91， 158-162, 1994) と連結させ、 12 等分した後、それぞれ 1000 1 のコンビテント · ハイ E.coli DH5 (東洋紡績社製、日本国）を形質転換した。その結果、それぞれ 8.3X 10⁴ 個の形質転換体を持つ 12 個の cDNA ライブラリ一のプ —ルが作製された（全ライブラリ一としては、 1.0X 10⁶個）。実施例 3

発現クローニングによる pRLF cDNAの取得

実験例 2で作製したラット初代培養肝細胞 cDNA ライブラリ一の各プ —ノレを 50 g/ml の Ampici 11 inを含む 15ml の 2XLB培地 ( 2 %Tryptone, 1 % yeast extract, 1 % NaCl , 0.2% Glucose) 中で一夜培養した後、その 0.5mlの培養液に加圧滅菌した 0.5mlのグリセリンを加えて混和し、 — 80°Cで保存した。この保存菌 200 μ 1 を 50 g/ml の Ampici 11 in を含む 50ml の LB培地（ 1 %Tryptone 0.5% yeast extract, 0.5%NaCl, 0.1% Glucose) 中で一夜培養した後、本質的に Molecular Cloning [Sambrook ら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] (こ言己載されてレヽるようにしてプラスミド DNAを抽出した。抽出したプラスミド DNA全量 200 g のうち 50 ig は、クロ口キン処理を含む DEAE- デキストラン法 ( Sompayrac LM et al. , Proc. Natl. Acad. Sci . USA 78, 7575 - 7578 1981 ； Luthman H et al. , Nucl. Acids Res 11, 1295 - 1308 1983) に若干の改変を加えた以下の方法に従い、 C0S1 細胞へトランスフエクシヨンした。 10%ゥシ胎仔血清（FCS)を含む Iscove's Modified Dulbecco's Medium ( IMDM) に浮遊させた C0S1 細胞（ATCC CRL1650) 1.5X 10⁶個をセルマトリックス（岩城硝子社製、日本国）にてコーティングした培養表面積 225cm² の組織培養用プラスティックフラスコ（コ一ニング社製'）に蒔き、 5 ¾；炭酸ガス培養器中にて 37°Cで一夜培養した。一方、 250mg/ml の DEAE-デキストラン（フアルマシア社製）、 48mM のクロ口キン（シダマ社製）、及び 8% (v/v) の Nu- Serum (コラボレイティブ社製）を含む 25ml の IMDMに 250 1 の HBS (21mM HEPES - 145mM NaCl, pH 7.1) に溶解した各プールのプラスミド DNA を混和し、トランスフエクシヨン直前に IMDM で 2度洗浄した上記の C0S1 細胞に添加した後、 5%炭酸ガス培養器中にて 37°Cで 3 時間培養した。その後、培養上清を吸引除去し IMDMでフラスコを 2度洗浄した後、 0.02%のゥシ血清アルブミン、 20 β g/ml のヒトインスリン（ギブコ社製）、 20 g/ml のヒ卜トランスフエリン（ギブコ社製）、 40μΜのモノエタノ一ルァミン（シグマ社製）、 Ο. ΙμΜ の亜セレン酸ナトリウム（シグマ社製）を含む IMDM を 65ml 力口え、 5%炭酸ガス培養器中にて 37°Cで 3 日間培養し、培養上清を回収した。得られた培養上清を F12 培地に対して十分に透析後、上述した in vitro アツセィ系で神経再生促進活性を測定した。その結果、一つのプ —ルのプラスミドをトランスフエクシヨンして発現させた C0S1 細胞の培養上清中に神経再生促進活性が認められた。

次に、活性が認められたプールの保存菌液を、 50μ g/mlの Ampicillinを含む CIRCLEGROW^TM (BIO 101 社製）培地で 10⁵倍に希釈し、 18 本のチュ —ブに 2.5ml づっ分注して一夜培養した [希釈液 50 μ 1 を Ampicillin を含む LB寒天培地（LB培地に 1.5%agar を添加）上に蒔き、 37°Cで一夜培養して出現するコロニーの数を数えることにより、 1 本のチューブには 8.2X 10³種類の cDNAクローンが含まれることを確認した。すなわち、 8.2X 10³個のプールが作成された。：]。この培養液 0.5ml に加圧滅菌したグリセロール 0.5ml を加えて— 80°Cに保存し、残リの 2ml から前述と同様にプラスミド DNA を精製し、各プールにつき 5 g を得た。さらにこのブラスミドを前述の方法で C0S1細胞へトランスフエクシヨンし（これ以降は、直径 60mmのシャーレを用い、スケールダウンして行った）、その培養上清中の神経再生促進活性を測定した。これにより、活性を有するプールを一つ得た。このようなスクリーニングを繰り返すことによつて、活性を有するプールの cDNA クローン数を 8.3X10⁴ 個、 8.2X 10³ 個、 1.5X 10³個、 220個と順次減らして行った。なお、活性を有するプールが 1 ラウンドのスクリーニングで複数得られたときは、その内の 1 プールを次のラゥンドのスクリ一ニングに用いた。プールのク口一ン数が 220個になったところで、プールの保存菌液を希釈して Ampicillinを含む LB 寒天培地上に接種し、一夜培養後コロニーを形成させ、 540 個の独立コロニーをピックアップした。ピックアップしたコロニー 20 個を 50 g/ml の Ampicillin を含む 2.5tnl の CIRCLEGR0W^TM(BI0 101 社製）培地に接種してひとまとめとしたプールを 27 個作った。プールの一夜培養液 2ml から前述と同様にプラスミド DNA を精製し、さらに C0S1 細胞へトランスフエクシヨンし、その培養上清中の神経再生促進活性を測定した。これにより、活性を有するプールを一つ得た。活性を有するプ —ルを構成する 20 個のコロニーについて、それぞれ別個に前述のとおリプラスミドを精製し、さらに C0S1 細胞へトランスフエクシヨンし、その培養上清中の神経再生促進活性を測定した。これにより、活性を有する cDNAクロ一ンを一つ得た。このクローンを pRLF と命名した。実施例 4

ラット pRLFcDNAのシークェンス構造解析

実施例 3で得られた cDNA クローン pRLF のプラスミド DNA の精製は本質的に Molecular Cloning [ Sambrook ら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] に記載されているようにして実施した。クローン pRLF を接種した 50 μ g/ml の Ampicillin を含む 40ml の CIRCLEGR0W^TM培地一夜培養液から約 700 g のプラスミド DNA を得た。得られたブラスミド DNA は、ユニバーサルプライマー及び明らかになつた cDNA の配列をもとに合成 [合成にはパーキンエルマ一社製 3 9 4 D NAZRNAシンセサイザー（ 3 -シァノエチルアミダイト法にもとづく合成機）を使用し、精製は同社製の合成 DNA 精製用 O P Cカラム (逆相シリ力ゲルを充填したカラムでトリチル基を持つ合成 0NAを精製するカラム）を用いて行った。精製した合成 DNA は T E溶液に 20 μ Μとなるように溶解し、使用時まで一 2 0 °Cに保存した] した 20 塩基前後のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 Taq Dye Deoxy™ Terrainater Cycle Sequening Kit (パーキンエルマ一社製； P C Rを利用した、蛍光色素で行なうジデォキシ法： Sanger F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467， 1977) を用い、アプライドバイオシステムズ社製 373ADNAシークェンサ一（蛍光シークェンサ一）により cDNA 全長の塩基配列を決定した。塩基配列を配列表（配列番号 2) に示した。実施例 5

ラット各種組織での pRLFm R N Aの検出

pRLF が完全長であるか否か、また mRNA の産生臓器を確認するため、 Rat Multiple Tissue Northern Blot [CLONTECH 社製；ラットの各組織の po ly(A)+RNA をブロッ卜したナイロンメンブレン] を用いてノザンブロッテイングを行なった。ノザンブロッテイングは本質的に Molecular Cloning [Sambrook. ら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989^1」に記載されているようにして実施した。プレハイブリダィゼイシヨンは 50%ホルムアミド、 5XSSC 、 5xDenhardt' s solution 、 1 % SDS、 200 g/ml サケ精子 DNA を含む 2 0 ml の溶液中で 4 2 °C 1 時間行なう。プローブは、 pRLF を制限酵素 Notl と EcoRI で消化した後、 0.8%ァガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、約 600bp の cDNA 断片を分離し、プレップ- A -ジーン DNA 精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製し、 Random Primer DNA labelling kit (宝酒造社製、日本国； Anal. Biochem. , 132， 6-13, 1983 に記載のランダムプライマ一法を利用した DNA標識キット）を用いて ³² Ρ標識したものを用いる。ハイブリダィゼイシヨンはプレハイブリダィゼイシヨンと同じ組成の溶液を 2 0 ml 使用し、プローブを加え 4 2 °Cで 2 0時間行なう。フィルタ一は 2XSSC/0.1%SDS溶液中室温で 5分間洗浄し、 0.1 X SSC/0.1 % SDS 溶液中で 6 8 °C 3 0分間の洗浄を 2回行なった後、 FUJIXバイオ . ィメージアナライザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社製、日本国）による解析を行った。その結果、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓において発現が見られ、その中でも肺及び肝臓における発現が比較的多かった（図 1 ) 。また、バンドの鎖長は約 1.6Kb であることから、 pRLFは不完全長と考えられた。実施例 6

PRLFの完全長クローンの取得

実施例 5の結果から、 pRLF は不完全長と考えられたので、 5' RACE 法による 5' 端の取得を行った。まず、 pRLFの揷入 cDNAの最上流に対応する 2つの PCR用プライマーを合成した。配列は以下の通りである： Flf ： 5， - GTGGTCAGGTTTGGCTCATA- 3 ' ( 配列表の配列番号 2の 52 -71 の相補鎖；配列番号 13) 。

Fig ： 5 ' -TGCTCTTCACAGGCCCCCT- 3 ' ( 配列表の配列番号 2の 33— 51 の相補鎖；配列番号 14) 。

また、 PEF1.8S のシークェンス用プライマーを作成した。配列は以下の通りである。

EF1 -2： 5 ' — GGATCTTGGTTCATTCTCAAG— 3 ' (配列番号 15 ； pEF18S のクローニングサイト EcoRI— Notl の EcoRI の外側に位置し、クロ一二ングサイトを視く方向）。

実施例 1及び実施例 2 と同様にラット肝初代培養細胞の mRNA より作成した cDNA ライブラリー（独立クローン； 3.2X 10⁶個）のプラスミドを铸型として、合成したプライマ一（Flf 及び EFla-2) 各 lOpmol を用いて PCRを行なった。 TaKaRaLA Taq (宝酒造社製）を使用して、 GeneAmp^TM PCR System 2400 ( パーキンエルマ一社製）によリ ΙΟΟμ Ι の容量で PCR (94°Cで 5 分間の変性を行った後、 94°Cで 30 秒間の変性条件、 57°Cで 30秒間のァニール条件、 72°Cで 2分間の合成条件で 35回の反応を行い、さらに 5 分間 72°Cで合成反応を行った）を行った。さらに、この反応液の 4倍希釈液 Ι μ ΐ をテンプレートとし、合成し'たプライマー（ Fig 及び EFl a-2) 各 lOpmol を用いて PCRを行なった。条件は初回と同様。この反応液を 2 %のァガロースゲルで泳動し、比較的大きく、鮮明なバンドを回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製した。この断片の塩基配列を直接プライマー； Flg、 EF1 α: -2で Taq Dye Deoxy^TM Terminater Cycle Sequening FS Kit ( ノ一キンエノレマ一社製）を用い、パーキンエルマ一社製 377DNA シークェンサ一によリ解析した。これにより、 332 塩基の上流配列（配列番号 3) を得た。しかし、なおノーザンの解析結果（全長約 1.6Kb) には及ばないため、さらに以下のような 5' RACE を繰り返した。まず、得た上流配列の N端に対応する 2 つの PCR用プライマ一を合成した。配列は以下の通りである：

Flh ： 5 ' - CCAAGTCCGTATCTCCATCA- 3 ' (配列表の配列番号 3の 118 一 137の相補鎖；配列番号 16) 。

Fli ： 5 ' -GGCAGTCCAGTATGCTACAT- 3 ' (配列表の配列番号 3の 36— 55の相補鎖；配列番号 17) 。

ラット脾臓 5' -RACE- Ready cDNA (CL0NTECH社製）を铸型として、合成したプライマ一； Flh及び Anchor Primer (5' - RACE - Ready cDNA に添付されている； cDNAの 5' 端に付加されたァンカ一に対応する）各 lOpmol を用いて PCR を行なった。 TaKaRa LA Taq (宝酒造社製、日本国）を使用して、 GeneAmp^TM PCR System 2400 ( パーキンエルマ一社製）によリ 50 1 の容量で PCR (94°Cで 45秒間の変性条件、 57でで 45秒間のァニ —ル条件、 72°Cで 2 分間の合成条件で 30 回の反応を行い、さらに 5 分間 72°Cで合成反応を行った）を行った。さらに、この反応液の 10 倍希釈液 4μ 1 をテンプレートとし、合成したプライマー； Fli 及び Anchor Primer 各 20pmol を用いて 100 1 の容量で PCR を行なった。条件は初回と同様。この反応液を 2 %のァガロースゲルで泳動し、一番鮮明なバンドを回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製した。この断片を PCR^TMII ベクタ一（TA Cloning® Kit； Invitrogen 社製）にクローン化した。得られたコロニーを錡型とし、 M13 Reverse Primer ( 5 ' 一 CAGGAAACAGCTATGAC - 3 ' ；配列番号 18) 、 M13(-20) Forward Primer

( 5， -GTAAAACGACGGCCAGTG- 3 ' ；配列番号 19) 各 7pmol を用いて PCR を行なった。 Amp 1 i Taq® (パーキンエルマ一社製）を使用して、 GeneAmp^TM PCR System 2400 ( パ一キンエルマ一社製）により 30 の容量で PCR

(94°Cで 5 分間の変性を行った後、 94°C30 秒間の変性条件、 47°Cで 30 秒間のァニール条件、 72°Cで 1 分間の合成条件で 35 回の反応を行い、さらに 5 分間 72°Cで合成反応を行った）を行った。反応液は 2 %のァガロースゲルで泳動し、バンドを回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製した。この断片の塩基配列を Anchor Primer及び Fli で Taq Dye Deoxy^T'" Terminater Cycle Sequencing FS Kit ( ノ一キンェルマ一社製）を用い、パーキンエルマ一社製 377DNA シークェンサ一により解析した。これにより、さらに 335塩基の上流配列（配列番号 4 ) を得た。ここで、この上流配列の N端に対応する PCR用プライマ一を合成した。配列は以下の通りである：

Flj ： 5 ' -TCCTCCTCGACACGCACTCC- 3 ' ( 配列表の配列番号 4 の 64 一 83の相補鎖；配列番号 20) 。

先のラット脾臓 5' -RACE- Ready cDNA を錡型とした、 Flh 及び Anchor Primer を用いた PCR反応液の 10 倍希釈液 4μ 1 を錡型として、合成したプライマ一； Flj 及び Anchor Primer各 20pmol を用いて PCR を行なつた。 TaKaRa LA Taq (宝酒造社製、日本国）を使用して、 GeneAmp^TM PCR System 2400 ( パ一キンエルマ一社製）により 100μ 1 の容量で PCR (94°C で 30 秒間の変性条件、 63°Cで 30 秒間のァニール条件、 72°Cで 1 分 30 秒間の合成条件で 30 回の反応を行い、さらに 5分間 72°Cで合成反応を行った）を行った。反応液は 2 %のァガロースゲルで泳動し、一番鮮明で、尚かつ長いバンドを回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製した。この断片を PCR^TMII ベクタ一にクローン化し、前回と同様に PCR を用いてコロニーから断片を調製し、塩基配列を決定した [プライマーは M13 Reverse Primer (前述）及び T7 Primer ( 5 ' - TAATACGACTCACTATAGGG- 3 ' ；配列番号 21) ]。これにより、さらに 317 '塩基の上流配列（配列番号 5 ) を得、全長は合計で 1571塩基に達し（配列番号 6 ) 、ノーザンの解析結果と一致したことから、ほぼ完全長を得たと考えられた。

DNA 解析ソフト "DNASIS" (日立ソフトエンジニアリング社製）を用いてホモロジ一サーチを行ったところ、配列番号 6のアンチセンスがヒト Be卜 2 binding component 3 ( GENBANK ACCESSION NO. U82987) と塩基レベルで 85.4 の相同性を持つことが判明した。一方、発現クロー二ングで得られたクローン pRLF (配列番号 2 ) 中には最高でも 24 アミノ酸の 0RF しか存在しないこと力同ソフトによる解析で明らかになつた。よって、クローン pRLF がコードする蛋白質（ペプチド）そのものに神経再生活性があるのではなく、クローン pRLF を導入することによつてなんらかの機構により C0S1 細胞から神経再生活性をもつ物質が分泌されている可能性が考えられた。そこで、以下のような実験を行った。実施例 7

pRLF導入 C0S1細胞の培養上清からの神経再生促進因子の精製

PRLF導入 C0S1細胞の培養上清の調製

pRLF を導入した時に C0S1 細胞培養上清中に分泌される神経再生促進因子を精製するため、 pRLF導入 C0S1 細胞の培養上清を約 300L調製した。以下にその詳細を示す。まず、 pRLF クローンを SO g/ml の Ampici llin を含む LB 培地で 37°C—夜振とう培養（3L の坂口コルベン当たり 1.5L の培地を入れた）し、遠心により 170Lの培養液よリ湿重量 850g の大腸菌を得た。この大腸菌 5g を 1 バッチとして、プラスミド抽出キット； RPM®-4G (BIO 101 社製）を用いて pRLF プラスミドを抽出した。これにより、 170L の一夜培養液より 300mgの pRLF プラスミドを得た。

プラスミド pRLF の C0S1 細胞へのトランスフエクションは、前述の方法（実施例 3 ) により行い、計 294L の pRLF導入 C0S1 細胞の培養上清を取得し、精製の供給源とした。

PRLF導入 C0S1細胞の培養上清からの神経再生促進因子の精製

取得した上清 294L (総蛋白質量； 81678m_g) を一度に処理することができなかったため、 30-50L の 7 つのロットに分けて精製を実施した。このうち、あるひとつのロットにおける精製例を代表として説明する。尚、精製の全ステップに於いて、神経再生促進活性は前述した DRG アツセィ系を用いて測定した。また、蛋白質の定量は、ステップ（ 1 ) から ( 3 ) まではク一マジ一色素結合法（PIERCE 社製試薬）を用いて、またそれ以降のステツプでは 280nm の吸収をもとに実施した。以下にそれぞれのロットについてまとめる：ロッ卜 1 42.81L, 蛋白濃度 0.297mg/ml, 総蛋白質量 12698mg ロッ卜 2 44.73L, 蛋白濃度 0.241mg/ral，総蛋白質量 10760mg □ッ卜 3 34.16L, 蛋白濃度 0.301mg/mし総蛋白質量 10290m_g □ッ卜 4 43.05L, 蛋白濃度 0.266mg/ml, 総蛋白質量 11438mg

Dッ卜 5 46.30L, 蛋白濃度 0.261mg/ml，総蛋白質量 12070mg

Dッ卜 6 43.92L, 蛋白濃度 0.290mg/ml, 総蛋白質量 12752mg ロット 7 39.15L, 蛋白濃度 0.298mg/ml，総蛋白質量 11670m_g<

( 1 ) 限外濾過膜分画

まず、 pRLF導入 C0S1細胞の培養上清ロット 1 ( 42.81L、蛋白濃度； 0.297mg/mK 総蛋白質量； 12698mg) から死細胞片を除くため 8000RPMで 3 0分遠心後、上清を回収した。次に、得られた上清を、 4°Cにて分子量 lOOKDaカット限外濾過膜（ポールフィルトロン社製、膜面積 0.46m²) で濾過した後、濾液を分子量 5KDa カット限外濾過膜（ポールフィルト口ン社製、膜面積 0.46m²)にて濃縮した。得られた 5KDa以下画分（40.73L、蛋白濃度；検出限界以下）、 5KDa 以上 lOOKDa 以下画分（320ml、蛋白濃度； 39.252fflg/ml、総蛋白質量； 12560mg) 、 lOOKDa以上画分（800ml、蛋白濃度； 3.084mg/ml、総蛋白質量； 2467mg) の 3つの画分の DRG アツセィの結果、神経再生促進活性は 5KDa以上 lOOKDa以下画分に検出されたため、この 5KDa以上 lOOKDa以下画分を次のステツプに進めた。

( 2 ) TSKge 1 QAE— トヨパール 550C (強陰イオン交換クロマトグラフィー）

( 1 ) で得られた 5KDa 以上 lOOKDa 以下画分（ 320ml、蛋白濃度； 39.252mg/ml, 総蛋白.質量； 12560mg) を 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0) にて 4倍希釈した後、 20πιΜ 卜リス塩酸緩衝液（ρΗ 8.0)にて予め平衡化してあった TSKgel QAE- トョパ一ル 550Cカラム（東ソ一社製、日本国； ø 5cm X 10cm) に 4 °Cにて 15nU/min の流速で添加し、素通り画分 Q1 ( 1900ml , 蛋白濃度 0.106mg/ml，総蛋白質量 201mg) を溶出した。次に、溶出液を 750mM NaCl を含む 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)に換えて、 5ml/min の流速で吸着画分 Q2 ( 590ml, 蛋白濃度 20.63 lmg/m 1，総蛋白質量 12172mg) を溶出した。 DRG アツセィの結果、神経再生促進活性は吸着画分 Q2 に検出されたため、この吸着画分 Q2 を次のステップに進めた。

( 3 ) Sephacryl S-200 HR (ゲル濾過クロマトグラフィ一）

( 2 ) で得られた TSKgel QAE— トヨパール 550C カラム吸着画分 Q2

(590ml, 蛋白濃度 20.631mg/inl，総蛋白質量 12172mg) を限外濾過ュニット（アミコン社製； YM3膜、直径 76iMi) で 100ml まで濃縮した。その後、 100ml の内の 50ml を PBS にて予め平衡化してあった Sephacryl S-200 HR カラム（フアルマシアバイオテク社製、 05cm x 100cm) に 4°Cにて 2.5m min の流速で添加した。溶出液を 50ml ずつチューブに集め、 DRG アツセィを行ったところ神経再生促進活性は分子量 30KDa から 5KDa に相当する FrlO から Frl6 (350ml, 蛋白濃度 4.303mg/ml, 総蛋白質量 1506mg) に検出された。同様にして残りの 50ml も Sephacryl S-200 HR カラムによる分画を行い、活性画分 FrlO から Frl6 (350ml, 蛋白濃度 4.480mg/mi, 総蛋白質量 1568mg) を取得した。このようにして 2回にわけたクロマトグラフィーにより取得した Sephacryl S-200 HR 活性'画分を 1 つの画分（ 700ml，蛋白濃度 4.391nig/nil，総蛋白質量 3074mg) にまとめ、限外濾過ュニット（アミコン社製； YM3膜、直径 76匪）で 50ml まで濃縮した。そして再度、 Sephacryl S-200 HR カラム（ファルマシアバイオテク社製、 <> 5cm X 100cm) に 4 °Cにて 2.5111 !^11 の流速で添加した。溶出液を 50ml ずつ分画し、 DRG アツセィを行ったところ神経再生促進活性は分子量 15KDa に相当する Frl3, 14 (100ml, 蛋白濃度 0.224mg/nil，総蛋白質量 22.039in_g) に検出されたため、この画分を次のステップに進めた。

このようにして、 7つのロットについて上記（ 1 ) から（ 3 ) までの精製を行い、それぞれのロットについて Sephacryl S-200 HR 活性画分を取得した。以下にそれぞれのロットの Sephacryl S-200 HR 活性画分についてまとめる：

ロット 1 ： 100ml，蛋白濃度 0.224mg/ml，総蛋白質量 22.039mg ロット 2 ： 50ml, 蛋白濃度 0.313m_g/mし総蛋白質量 15.672mg ロット 3 ： 50ml, 蛋白濃度 0.366mg/nil, 総蛋白質量 18.300mg ロット 4 ： 50ml, 蛋白濃度 0.316mg/nil，総蛋白質量 15.800mg ロット 5 ： 100ml, 蛋白濃度 0.230mg/ml，総蛋白質量 22.950mg ロット 6 ： 50ral, 蛋白濃度 0.305mg/nil, 総蛋白質量 15.240mg ロット 7 ： 50ml, 蛋白濃度 0.245m_g/ml, 総蛋白質量 12.250mg。

( ) Shodex IEC DEAE-2025 (弱陰ィォン交換クロマトグラフィ一）

( 3 ) で得られたロット 1、 Sephacryl S-200 HR 活性画分（ 100ml，蛋白濃度 0.224mg/ml, 総蛋白質量 22.039mg) とロット 2、 Sephacryl S-200 HR活性画分（50ml，蛋白濃度 0.313m_g/ml，総蛋白質量 15.672mg) を 1 つの画分（150ml, 蛋白濃度 0.251mg/ml，総蛋白質量 37.711mg) にまとめ、限外濾過ュニット（アミコン社製； YM 3 膜、直径 76mm) で 5 ml まで濃縮した。これに 20mM トリス塩酸緩衝液（ρΗ 8· 0)を 50 ml 加え、再び 5 ml まで濃縮した。さらにこの操作をもう一度繰り返し、 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)に置換された Sephacryl S-200 HR 活性画分

(12ml, 蛋白濃度 3.143mg/ml，総蛋白質量 37.711mg) を得た。この画分を展開溶媒 Aに 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)、展開溶媒 Bに 750mM NaCl を含む 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)を用い、 0% Bで平衡化した Shodex IEC DEAE-2025カラム（昭和電工社製、日本国； ø 2cm x 15cm ) に、流速 2ml/min で室温にて注入した。注入終了後、 10 分間で 20% B にした後、さらに 20% Bから 60% Bまで 70分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 4ml ずつ分画し、 DRG アツセィを行ったところ神経再生促進活性は約 250mMの NaCl濃度を有する Fr39， 40(8ml ,蛋白濃度 0.02mg/ml, 総蛋白質量 0.16m_g) に検出されたため、この画分を次のステップに進めた。同様にして残りのロットの Sephacryl S-200 HR 活性画分についてもロット 3 とロット 4を合わせた画分、ロット 5 とロット 6 を合わせた画分、およびロット 7の 3回にわけ、それぞれ Shodex IEC DEAE-2025 による精製を行い、 Shodex IEC DEAE- 2025活性画分を取得した。

以下にそれぞれのロットの Shodex IEC DEAE-2025 活性画分についてまとめる：

ロッ卜 1 & 2 8ml, 蛋白濃度 0.02mg/ml，総蛋白質量 0.16mg；ロッ卜 3 & 4 8ml, 蛋白濃度 0.02mg/ml, 総蛋白質量 0.16mg；ロッ卜 5 & 6 8ml，蛋白濃度 0.025mg/ml，総蛋白質量 0.2mg；ロット 7 ： 8ml, 蛋白濃度 0.01m_g/ml, 総蛋白質量 0.08mg。

( 5 ) YMC-Pack PROTEIN RP (逆相クロマトグラフィ一）

( ) で得られた各口ットの Shodex IEC DEAE-2025 活性画分を 1 つの画分（32ml，蛋白濃度 0.0188mg/ml，総蛋白質量 0.6mg) にまとめ、限外濾過ュニット（アミコン社製； YM 3 膜、直径 43mm) で 4ml まで濃縮した。この画分に 2-プロパノール 0.5ml、ァセトニトリソレ 0.5ml、トリフルォロ酢酸（TFA) 0.0025ml を加え、最終体積 5.0025ml、最終有機溶媒濃度 20%、 TFA 濃度 0.05 %に調製した。これを展開溶媒 Aに 0.1% TFA、展開溶媒 Bに 0.08% TFA を含む 2-プロパノール/ァセトニトリル = 1/1 (容量比）を用い、 40% Bで平衡化した YMC-Pack PROTEIN RP カラム（YMC社製、 ø 2. lram x 150mm ) に、流速 0.2ml /min で注入した。注入終了後、 40% Bから 60% Bまで 30 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 0.4ml ずつ分画し、 D R Gアツセィを行ったところ神経再生促進活性は約 50%の有機溶媒濃度を有する Fr44,45 ( 0.8ml , 蛋白濃度 0.012mg/ml, 総蛋白質量 0.0096mg) に検出されたため、この画分を次のステップに進めた。

( 6 ) 電気泳動ゲル上の活性蛋白質バンドの同定

( 5 ) で得られた YMC- Pack PROTEIN RP 活性画分の一部を用いて電気泳動による分析を行った。電気泳動は常法（Laemml i 、 Nature, 227 巻、 680-685 頁、（ 1970)) に従って行った。活性画分 0.8ml のうちの 5.4^ 1 を遠心エバポレーシヨンし、還元剤を含まないドデシル硫酸ナトリウム（SDS)ゲル電気泳動サンプルバッファ一を 10 1 加え、 95°Cで 5 分処理した後、 15-25% SDS-ポリアクリルアミドブレキャストゲル（第一化学薬品社製、日本国）を用いて SDSゲル電気泳動し、 2D-銀染色試薬 - 「第一」銀染色キット（第一化学薬品社製、日本国）で染色した。分子量マーカ一には「第一」 · III 低分子量マーカー（第一化学薬品社製、日本国）を用いた。その結果、電気泳動ゲル上には複数のバンドが検出され、活性画分には複数の蛋白質が存在していることが判明した。そこで電気泳動ゲル上の活性蛋白質バンドの特定を行うため、電気泳動ゲルからの神経再生促進活性の抽出実験を行った。活性画分 0.8ml のうちの 8 1 を遠心エバポレーシヨンし、還元剤を含まない SDS ゲル電気泳動サンプルバッファーを 10 μ 1加え、 55°Cで 10分処理した後、 15-25% SDS- ポリアクリルアミドブレキャストゲル（第一化学薬品社製、日本国）を用いて SDS ゲル電気泳動を行った。分子量マ一カーには、プレスティンド . ブロードレンジマ—力— （ニューイングランドバイオラボ社製）を用いた。泳動終了後、プレステインド ' ブロードレンジマーカ一の分子量 16.5KDa バンドをめやすとして、サンプルを添加した領域のうち 16.5KDa バ'ンドより低分子量領域を幅 1.6mm ずつ 14 本のゲルにカットした。カットした 14 本のゲルをそれぞれ I.25 t g のトランスフェリンを含む 500 1 の精製水を入れたエツペンドルフチューブの中に入れた後、チューブをローテ一ターに設置し 4 °Cにて回転させた。 16 時間後抽出液を回収し、新たに 1.25 g のトランスフエリンを含む 500μ 1 の精製水を加えた。 4 °Cにて 4 時間回転させた後、抽出液を回収し、最初に回収した抽出液とあわせてゲル中に存在した蛋白質の抽出液 1ml を取得した。その後、抽出液中に存在する遊離 SDS を除くため各チューブに 1 Mリン酸カリウム（ pH 6.8 )を 20 μ 1 加え、 4 °Cにて 4時間放置した。さらに、生成した沈殿を除去するため、 10000 rpm、 10 分間の遠心を行い、上清を回収する事によりゲル中に存在した蛋白質の抽出液を取得した。この抽出液をアツセィ培地で透析した後、 DRG アツセィを行つたところ、神経再生促進活性は分子量約 14500Da に相当する No.3 及び No.4 のゲル抽出液に検出された。前述の銀染色を行った泳動ゲル上にはこの分子量に相当する位置に蛋白質バンドが存在していたため、この分子量約 14500Daの蛋白質が活性蛋白質であることが判明した。

( 7 ) 電気泳動による分離とポリビニリデンジフルオリド（PVDF)膜へのエレクトロブロッテイング

( 6 ) に記述したように YMC- Pack PROTEIN RP活性画分中の活性蛋白質は電気泳動によリ他の蛋白質と分離できることがわかったため、残リの YMC-Pack PROTEIN RP 活性画分全てを電気泳動によリ分離した。 YMC- Pack PROTEIN RP 活性画分 786.6 1 を遠心エバポレーシヨンし、還元剤を含まない SDSゲル電気泳動サンプルバッファーを 30 1 加え、 95°C で 5 分処理した後、 15-25% SDS-ポリアクリルアミドブレキャストゲル

(第一化学薬品社製、日本国）を用いて SDS ゲル電気泳動した。分子量マーカ一には、「第一」 · III 低分子量マ一力一（第一化学薬品社製、日本国）及びプレステインド · ブロードレンジマーカ一（ニューイングランドバイオラボズ社製）を用いた。泳動終了後、セミドライ転写装置

(オール社製）を用いて、常法に従い、 150mA の一定電流で 3 時間かけ' て PVDF膜（パーキンエルマ一社製 ProBlott) に転写を行った。陽極液に、 0.3M Tris, 20%メタノール， pH10.4、転写膜液に、 25mM Tris, 20% メタノール， pH10.4、陰極液に、 25mM Tris, 40mM ァミノカブロン酸， 20% メタノール， ρΗΙΟ.4 を用いた。転写された膜をクマシ一 · プリリアント · ブル一（ CBB )染色液（40%メタノ一ル、 1%酢酸中に 0.1%の CBB R-250 を含む）で染色し、 50%メタノールで脱染色したところ、（ 6 ) に記述した銀染色と同等の染色パターンが検出された。活性本体である分子量約 14500Da の蛋白質バンドも染色されており、ここに p RLF 導入 C0S1 細胞培養上清中の神経再生促進因子の精製が完了した。取得された活性本体蛋白質の量は CBB染色の染色度から約 200ngと推定された（図 2 ) 。実施例 8

神経再生促進因子の部分アミノ酸配列の分析

岩松の方法（岩松ら、新基礎生化学実験法、第 4巻、 33〜84 頁（丸善刊、東京、日本国）；岩松明彦、生化学、第 63巻、第 2号、 139-143頁、 ( 1991) (日本国）； Akihiro Iwamatsu, E 1 ectorophores i s、第 13巻、 142-147 頁、（1992)) により、実施例 7の（ 7 ) で得られた PVDF 膜上に転写された分子量約 14500Daの神経再生促進活性を有する蛋白質のァミノ酸配列の分析を行った。

( 1 ) 還元 S-カルボキシメチル化

実施例 7の（ 7 ) で得られた PVDF 膜上の CBB 染色された分子量約 14500Da の神経再生促進活性を有する蛋白質バンドを切り出し、エツべンドルフチューブに入れた lmg のジチォスライト一ル（DTT)を含む還元溶液（8M グァニジン、 0.3%エチレンジァミン四酢酸（EDTA)、 0.125M リジンを含む 0.5M トリス塩酸緩衝液（pH 8.3)) 100 1 中に浸し、 60°C にて 1 時間放置した。これに、 3mg のモノョード酢酸を加え、チューブを遮光して 15 分間激しく撹拌した。その後、 ' PVDF 膜を精製水、 2%ァセトニトリル、 0. USDS で順次洗浄して膜上に残っている過剰の試薬を除去した。このようにして PVDF 膜上にて還元 S-カルボキシメチル化された分子量約 14500Daの神経再生促進活性を有する蛋白質を取得した。

( 2 ) ぺプチド断片化とペプチドマッピング · ァミノ酸配列分析取得した蛋白質から複数の内部アミノ酸配列情報を得るため、酵素消化にょリ蛋白質をペプチドに断片化した。酵素消化に先立ち、 PVDF 膜を 0.5%ポリビニルピロリドン（PVP)-40、 ltng のメチォニンを含む 100mM 酢酸 100 1 に浸し、室温で 30 分間放置することにより膜上の蛋白質未結合部分をブロックした。その後、 10%ァセトニトリルで洗浄して過剰の試薬を除去した。洗浄した膜を 10%ァセトニトリルを含む 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 9.0) 20 1 の入ったチューブに移し、リシルェンドぺプチタ"一ゼ（Achromobacter Protease I ；和光純薬工業製、日本国） 5pmol を加え、 40°Cにて 3 時間の消化を行った。酵素消化により断片化され PVDF 膜から遊離してきたべプチドフラグメントを消化液中に回収した。消化液中に存在しているペプチドフラグメントを展開溶媒 Aに 0.05% TFA、展開溶媒 Bに 0.02% TFA を含むイソプロパノール：ァセト二トリル =7： 3 の混液を用いて、 Symmetry C18 逆相カラム（ウォーターズ社製、 ø 1.0mm X 50πιπι) で、カラム温度 40°C、流速 0. lml/min、 1%B から 50%B を 30分の直線濃度勾配にて展開することにより分取した（図 3 ) 。得られたそれぞれのペプチドフラグメントを気相アミノ酸シークェンサ一（島津製作所製、 PPSQ-2) にてエドマン分解後、順次回収された N末端の PTHアミノ酸を、ァイソクラティック溶出法による C18逆相カラムクロマトグラフィ一にて同定を行った。同定可能であったフラグメントのァミノ酸配列を次にまとめた（アミノ酸は一文字表記による）：

A P 2 ： P G E C L R V R G E VA (配列番号 22) ；

A P 4 ： L P D GY E (配列番号 23) ；

A P 6 ： D S NN L C L H F N (配列番号 24) 。

上記アミノ酸配列のデータベースによる検索を行ったところ、ヒトガレクチン- SWISS-PR0T データベース登録番号 P09382)のアミノ酸配列と完全に一致していた。この結果よリ pRLF導入 C0S1 細胞培養上清中の神経再生促進因子はサルガレクチン- 1 である可能性が最も高いと結論した。実施例 9

ヒトガレクチン- 1 cDNAの取得

まず、 GENBANK ACCESSION NO. J04456 をもとにヒトガレクチン一〖 cDNA に対応する PCR用プライマーを合成した。配列は以下の通りである： HLEG1 ： 5 ' — TGCGCCTGCCCGGGAACATC - 3 ' ( GENBANK ACCESSION NO. J04456の 15— 34；配列番号 25) ；

HLEG2 ： 5 ' - GAACATCCTCCTGGACTCAA- 3 ' ( GENBANK ACCESSION NO. J04456の 28— 47 ；配列番号 26) ；

HLEG6 ： 5 ' 一 GCTGCCTTTATTGGGGGCCA - 3 ' ( GENBANK ACCESSION NO. J04456の 472— 491 の相補鎖；配列番号 27) ；

HLEG8 ： 5 ' - GAGAGAGCGGCCGCATTGGGGGCCATGGGCTGGC- 3 ' ( GENBANK ACCESSION NO. J04456 の 463— 482 の相補鎖の 5 ' に Notl サイトを付加した；配列番号 28) 。

Superscript™ Human Liver cDNA Library (GIBCO BRL 社製）の大腸菌ストック 2 μ 1 をテンプレートとし、合成したプライマ一（HLEG1 及び HLEG6) 各 40pmol を用いて PCR を行なった。 TaKaRa LA Taq (宝酒造社製、日本国）を使用して、 GeneAmp^TM PCR System 2400 ( パーキンエルマー社製）によリ 100 μ 1 の容量で PCR(94°Cで 5分間の変性を行い、 94°C で 30秒間の変性条件、 60°Cで 30秒間のァニール条件、 72°Cで 1分間の合成条件で 35回の反応を行い、さらに 5分間 72°Cで合成反応を行った）を行った。さらに、この反応液 Ι μ ΐ をテンプレートとし、合成したプライマー（HLEG2及び HLEG8) 各 40pmo 1 を用いて PCRを行なった。条件はァニール温度が 55°Cとなる以外初回と同様。この反応液をフエノールークロロホルム（ 1 ： 1 ) 処理後、 1/10 量の 3M NaOAc 及び 2倍量のエタノールを力！]えて遠心し、ペレットを得た。ぺッレットは T4 DNA polymerase (ベ一リンガーマンハイム社製）で平滑化し、 Notl で消化後、 2 %のァガロースゲルで泳動し、予想される約 460bp の大きさの断片を回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製した。この断片を EcoRI で消化した後 T4 DNA polymeraseで平滑化し、さらに NoU で消化した PEF18S にクローニングした（宿主は E. col i DH5 を使用した）。得られたクローンの揷入配列をプライマ一； EF 1 α - 1 ( pEF18S のクロ一ニングサイト EcoRI— NoU の EcoRI の外側に位置し、クロー二ングサイトを視く方向； 5 ' - CCTCAGACAGTGGTTCAAAG- 3 ' ；配列番号 29) , polyAC2 ( pEF18S のクロ一ニングサイト EcoRI— Notl の Notl の外側に位置し、クローニングサイトを靦く方向； 5 ' - TGCATTCATTTTATGTTTCAG- 3 ' ；配列番号 30)各 7pmo 1 を用いて PCR(94°C 5分間の後に、 94°C 30秒間 / 50°C 30秒間 72°C 1 分間の条件で 35回の反応を行う）により増幅した後、 2 %のァガロースゲルで泳動し、予想される約 500bp の大きさの断片を回収してプレップ一 A -ジ一ン DNA 精製キットで精製した。この断片の塩基配列をプライマ一； EFl a - 1, o lyAC2で Taq Dye Deoxy™ Termi nater Cycle Sequening FS Kit ( ノヽ —キンエルマ一社製）を用い、パ一キンエルマ一社製 377DNA シークェンサ一により解析した。これにより、開始コドンから終始コドンまでの正しぃヒトガレクチン -1 cDNA の塩基配列を有するクローン pEFGall ( GENBANK ACCESSION NO. J04456の 50— 457) を得た。実施例 1 0

ヒトガレクチン- 1 cDNA クローン pEFGaU の C0S1 細胞発現蛋白質（以下この蛋白質を C0S1 細胞発現 Gall ( 1-134) と称す。）の DRG 活性の確認

実施例 9で取得したヒトガレクチン -lcDNA を組み込んだプラスミド pEFGall を C0S1 細胞へトランスフエクシヨンし、 C0S1 細胞培養液中、およひ' C0S1 細胞から抽出した Gall ( 1 — 134) が神経再生促進活性を有するかどうかの確認を行った。

クローン pEFGall は 50^g/ml の Ampicillin を含む 100ml の LB培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体から QIAGEN Plasraid Maxi Kit ( QIAGE 社製）を用いてプラスミドを抽出した。プラスミド pEFGall の C0S1 細胞へのトランスフエクシヨンは、トランスフエクタム試薬 [プロメガ社製、ジォクタデシルァミドグリシルスペルミン（D0GS)]を用いて行った。培養表面積 225cm² の組織培養用ブラスティックフラスコに 5 X 10⁶個の C0S1 細胞を蒔き、 10%FBS を含む IMDM培地中にて一晚培養した。 IMDM培地 20ml で洗浄後、新たに IMDM培地 6.5m 1 を添加した。さらにプラスミド pEFGall 65 g を含む IMDM培地 6.5m 1 とトランスフェクタム試薬 325 を含む IMDM培地 6.5ml を混合し、これを添加し、 37°Cにて 6時間培養した。その後、培養液を吸引除去し、新たに 10%FBS を含む IMDM培地 52ml を添加し、 2 日間培養を行った。培養終了後、培養上清 50ml および細胞を回収した。培養上清は 5mM DTT を含む PBS 2L で一晩透析後、濾過した。一方細胞は lOOmM ラクト一ス、 5mM DTT を含む PBS 10ml 中にてホモジナイズした。その後、 4°Cにて 10000G、 30分の遠心分離を行い、上清を回収し、 5mM DTT を含む PBS 2L で一晩透析後、濾過し、細胞抽出液とした。得られた培養上清および細胞抽出液をそれぞれ 5mM DTT を含む PBS にて平衡化したラクトースァガロースカラム（ホーネン社製、 ø 5.0 nun X 50 mm ) に、流速 0.25ml/min で添加し、素通り画分を溶出した。次に、溶出液を lOOmMラクト一ス、 5mMDTT を含む PBS に換えて，吸着画分を溶出した。電気泳動による分析の結果、培養上清および細胞抽出液とも吸着画分に分子量 14500Da の Gall ( 1 一 134) が検出された。そこでそれぞれの吸着画分をアツセィ培地にて十分透析した後 DRGアツセィを行ったところ、 5 - 50 pg/ml の濃度（ゲルの染色度から推定）で高い神経再生促進活性が検出された。これによリ、 C0S1 細胞で発現した Gall ( 1 — 134) は培養液および細胞中に存在し、いずれも高い神経再生促進活性を有していることが確認された。実施例 11

Gall ( 1 — 134) の大腸菌発現用ベクターの構築

大腸菌発現ベクターである pET— 3d (ストラタジーン社製）によって、 Gall (1— 134) を発現させるために、次のことを行った。まず、 pEFGall を铸型として、 2本の P C R用プライマー； HLEG12, HLEG14 を用いて PCR

(94°C 5分間の後に、 94°C 30秒間ノ60 30秒間/ 1 分間の合成条件で 25回の反応を行い、さらに 72°Cで 5分間反応させる）を行った。増幅されたヒトガレクチン- 1 の開始コドンから終止コドンまでを含む断片を Ncol と BamHIで消化後 0.8%のァガロースゲルで泳動し、約 420bp の大きさの断片を回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製し、 Ncol と BamHI で消化した pET— 3d に揷入（宿主は E.coli DH5a を使用した）した。正しいヒトガレクチン- 1 cDNA の塩基配列を有するクロ一ン pETGall (1- 134) (ベクターの Ncol から BamHI までの塩基配列を配列番号 7 に示す）を、塩基配列の解析により選択した。 GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit ( フアルマシア社製）を用いてプラスミドを抽出し、 Epicurian Coli BL21(DE3) Competent Ce 1 is (ストラタジーン社製； Lysogenic Lambda phage の Lac UV5 下流に T7 RNA polymerase 遺伝子がある）に形質転換して得られた大腸菌株を Gall (1— 134) 発現用の形質転換体とした。ここで用いた PCR用プライマ一の配列は以下の通りである：

HLEG12： 5 ' - AGAGTGGATCCTTATCAGTCAAAGGCCACACATTTG- 3 ' (GENBANK ACCESSION NO. J04456の 436— 457の相補鎖の 5 '端に BamHI サイトを付加した；配列番号 31) ；

HLEG14： 5 ' -GAGAGACCATGGCTTGTGGTCTGGTCGC- 3 ' (GENBANK ACCESSION NO. J04456の 50— 69の 5 '端に Ncolサイトを付加した；配列番号 32) 。実施例 1 2

大腸菌で発現した Gall (1- 134) の精製と活性確認

ヒトガレクチン- 1 cDNA を組み込んだ大腸菌発現用プラスミド pETGall (1- 134)を導入した大腸菌より Gall ( 1 — 134) を取得し、神経再生促進活性を有するかどうかの確認を行った。

実施例 1 1 で得られたクローンを、アンピシリン 50 μ g/ml を含む L B 寒天培地上に塗布し、 37°Cで一晩培養してコロニーを形成させ、このコロニ一 1個をアンピシリン 50μ g/mlを含む L B培地 50mlで振盪培養し、この培養液を初発の 0D_6OQが 0.2 となるようにアンピシリン 50 g/ml を含む L B培地 1000ml に加え、 0D_6QOが 0.5-0.6 に至るまで 37°Cで振盪培養した。次いで最終濃度が、 0.1 mMになるように I P T Gを添加し、さらに 3時間振盪培養して、 Gall ( 1- 134) の発現を誘導した。菌体培養液 1L を 10000Gで 30分の遠心分離を行い、 Gall ( 1 — 134) 発現菌体ぺレットを得た。ペレットを 20ml の PBS に懸濁し、氷冷下にて超音波破砕した。菌体破砕液を 10000Gで 30分の遠心分離し、上清中に可溶性蛋白として Gall ( 1 — 134) を回収した。回収した上清を 2L の 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)で一晩透析後、展開溶媒 Aに 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)、展開溶媒 Bに 500mM NaCl を含む 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)を用い、 0% Bで平衡化した Shodex IEC DEAE-2025 カラム（昭和電工社製、日本国； 02cm X 15cm ) に、流速 2ml/min で室温にて注入した。注入終了後、 0% Bから 30% Bまで 60 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 4ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、約 80mMの NaC〖濃度を有する画分に分子量 14500Da の Gall ( 1 - 134) と思われるバンドが検出されたため、この画分（15ml) を次のステップに進めた。ここで、 Gall ( 1 — 134) のァミノ酸配列には 6 個のシスティンが含まれているため、神経再生促進活性を有した pRLF導入 COS 1細胞培養上清中のヒトガレクチン- 1 には SS結合が形成されていた可能性が高い。そこで酸化剤として硫酸銅を用いて SS 結合形成反応（リフォールデイング）を行った。 DEAE カラムの Gall ( 1 — 134) 画分（15ml) を 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)で 20倍に希釈し、最終濃度 0.0001%になるように 1¾硫酸銅水溶液を添加した後、 4°Cにて一晩放置した。反応液 300ml を限外濾過ユニット（アミコン社製； YM 3 膜、直径 76丽）を用いて濃縮し、さらに 20mM酢酸ナトリゥム緩衝液（pH 5.0)にバッファー交換した。（最終溶液量 50nU)これを展開溶媒 Aに 20mM 酢酸ナトリゥム緩衝液（pH 5.0)、展開溶媒 Bに 500mM NaCl を含む 20mM 酢酸ナトリゥム緩衝液（pH 5.0)を用い、 0% Bで平衡化した TSKgel SP-5PW カラム（東ソ一社製、日本国； ø 7.5mm X 75mm) に、流速 0.5ml/minで室温にて注入した。注入終了後、 0% Bから 40% Bまで 60 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 1ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、約 150mMの NaCl濃度を有する画分に分子量 14500Da の Gall ( 1 - 134) と思われるバンドが検出されたため、この画分（8ml) を次のステップに進めた。 SP カラムの Gall ( 1 — 134) 画分（8ml) を展開溶媒 Aに 0.1%TFA、展開溶媒 Bに 0.1%TFA を含む 80%ァセトニトリルを用い、 40% Bで平衡化した YMC PROTEIN RPカラム（YMC社製 010mm X 250mm) に、流速 2.0n /min で室温にて注入した。注入終了後、 40% Bから 50% Bまで 60分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 2ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、約 34%と約 36% のァセトニトリル濃度を有する二つの画分に分子量 14500Daの Gall ( 1 - 134) と思われるバンドだけが検出された。この二つのバンドは非還元下の電気泳動では移動度が若干異なるが、還元処理後の電気泳動では移動度が一致していた。このことより、この二つのバンドは SS 結合架橋様式の異なる Gall ( 1 - 134) であることが推測された。

このバンドが Gall ( 1 - 134) であることを確かめるため、約 36%のァセトニトリル濃度で溶出された画分を用いて N末端アミノ酸配列分析およびァミノ酸組成分析を行った。

まず、プロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社製、 492 型）を用いて N末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、次に示す N末端ァミノ酸配列が検出された（Xは未同定である）：

(配列番号 33)

この配列は Gall" ( 1 - 134) の N 末端ァミノ酸配列に一致しており、 PROTEIN RP カラムにより精製した蛋白が Gall ( 1 — 134) であることが確認された。次に 6N 塩酸による酸加水分解後のアミノ酸組成分析を行つた。サンプルを PICO · TAG ワークステーション（ゥオーターズ社製）を用いて 6N 塩酸による気相酸加水分解（150°C、 1時間）を行った後、 AccQ - Fluor 試薬（ウォーターズ社製）によリ蛍光誘導体化反応を行つた。その後、 AccQ ' Tag アミノ酸分析システム（ウォーターズ社製）により、アミノ酸分析を行った。その結果、次に示すアミノ酸組成比が検出された。括弧内に Gall ( 1 — 134) の理論値を示す：

Asp :22.18(22), Ser: 5.51(5), Glu: 10.30(10), Gly: 11.38(11), His :2.12 (2)， Arg:5.10(5), Thr :3.89(4), Ala: 13.90 ( 14) , Pro : 7.09(7),Tyr:2.08(2 ),Val :9.23 (10), Met: 1.15(1), Lys :7.97(8), I le: 3.29(4), Leu: 11.85(12), Phe:9.96(10) ( Cys, Trpは未同定）。

このように精製蛋白のアミノ酸組成比は Gall ( 1 — 134) の理論値と非常によく一致しており、精製蛋白は Gall ( 1 — 134) であり、その純度は非常に高いことが確認された。

同様にして約 34 のァセトニトリル濃度で溶出された画分についても N 末端アミノ酸配列分析およびアミノ酸組成分析を行った。その結果、いずれの分析においてもこの画分に溶出された蛋白が Gall ( 1 — 134) であることが確認された。そこでアミノ酸分析の結果よリサンプル中の Gall ( 1 - 134 ) の濃度を決定し、それぞれの画分を 0.5， 5, 50， 500, 5000pg/ml にアツセィ培地によリ調整後、 DRG アツセィにょリ神経再生促進活性を測定した。その結果、両面分の Gall ( 1 — 134) は 0.5pg/ml から 500pg/ml において濃度依存的に神経再生促進活性を示した（図 4 ) 。これにより、硫酸銅による酸化行程を経て分子内に S S 結合を形成した大腸菌発現 Gall ( 1 — 134) は神経再生促進活性を有していることが確認された。実施例 1 3

大腸菌発現 Gall ( 1 — 134) の SS結合架橋様式の同定

実施例 1 2で取得した大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) (約 36%のァセト二トリル濃度で溶出された画分）の SS 結合架橋様式の同定を酵素消化後のペプチドフラグメントの質量分析を行うことによリ実施した。大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) 画分 50 1 (15^g 相当；アミノ酸分析によリ濃度決定）を遠心エバポレーシヨンした後、 lOOmM トリス塩酸緩衝液緩衝液（pH 6.8) 20 1 に溶解し、トリプシン（ベーリンガー社製） 0.6 g を加えて、 37°Cにて 16 時間の消化を行った。消化液中に存在しているぺプチドフラグメントを展開溶媒 Aに 0.05% TFA、展開溶媒 Bに 0.02% TFA を含むイソプロパノール：ァセトニトリル = 7 '· 3の混液を用いて、 Symmetry C 18 逆相カラム（ウォーターズ社製、 ø 2. Omm x 50mm) で、カラム温度 40°C、流速 0.25ml/min、 1¾B から 50%B を 50 分の直線濃度勾配にて展開することにより分取した（図 5 ) 。得られたそれぞれのぺプチドフラグメント溶液の一部（0.5μ 1) をサンプルプレート上にスポットし、さらにァセトニトリル： 0. TFA=50:50 の溶液に 10mg/ml の濃度で溶解した a-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)、 0.5μ 1 ,を添カロし、混合後風乾した。これを Matrix-Assisted Laser Desorpt ion Ionization Time- of-Fl ight(MALDI-TOF)型質量分析計（パーセプティブ社製、 Voyager Elite) により質量分析を行った。以下に、フラグメント番号、検出された質量数および質量数から帰属されたアミノ酸配列を示す：

TP1 786.429 G²¹EVAPDAK²⁸ (配列番号 34) ；

TP2 534.028 F^1C8PNR (配列番号 35) ；

TP3 1042.15 V¹⁹RGEVAPDAK²⁸ (配列番号 36) ；

TP4 1077.29 D⁶⁴GGAWGTEQR⁷³ (配列番号 37) ；

TP5 969.466 L^1<)()PDGYEFK^l°⁷ (配列番号 38) ；

TP6 3021.11 D³⁷SNNLC⁴²LHFNPR⁴⁸ (配列番号 39) +F ⁹NAHGDANTI VC⁶⁰NSK⁶³

(配列番号 40) ；

TP7 878.451 S²⁹FVLNLGK³⁶ (配列番号 41) ；

TP8 1785.14 L¹¹²NLEAINYMAADGDFK¹²⁷ (配列番号 42) ；

TP9 5222.08 A^lC²GLVASNLNLKPGEC¹⁶LR¹⁸ (配列番号 43)

+E⁷⁴AVFPFQPGSVAEVC⁸⁸ITFDQANLTVK" (配列番号 44) +C¹³⁰VAFD¹³⁴ (配列番号 45) 。

この結果より大腸菌発現 Gall ( 1 — 134) (約 45%のァセトニトリル濃度で溶出された画分）は 3 組の SS結合で架橋しており、その 1 組は Cys42- Cys60であること、また Cys88 および Cys 130 もそれぞれ Cys2か Cys 16 のいずれかと架橋していることが判明した。そこで残リの 2組の SS 結合架橋様式の同定を行うため、 TP9 にリジルエンドべプチダーゼ (和光純薬社製、日本国）を加え 2 次消化を行った。 TP9 を遠心エバポレーション後、リシルェンドぺプチダ一ゼ（和光純薬社製、日本国） 20pmol を加え、 100mM トリス塩酸緩衝液（pH 6.8) 20 中にて 37°C、 16時間の消化を行った。その後、消化液中に存在しているペプチドフラグメントを展開溶媒 Aに 0.05 TFA、展開溶媒 Bに 0.02% TFA を含むイソプロパノール：ァセトニトリル =7： 3 の混液を用いて、 Symmetry C18 逆相カラム（ウォーターズ社製、 ø 2.0mm X 5 Omni) で、カラム温度 40°C、流速 0.25ml /mi n、 1%B から 50%B を 50 分の直線濃度勾配にて展開することによリ分取した（図 6 ) 。得られたペプチドフラグメントを遠心ェバポレ一ションした後、 MALDI-T0F型質量分析計（パーセプティブ社製、 Voyager El ite) により質量分析を行った。以下に、フラグメント番号、検出された質量数および質量数から帰属されたアミノ酸配列を示す： TPAP1 1755.31 A^^LVASNLNLK¹² (配列番号 46)

+_ci3o_VAFDi34 (配列番号 47) ；

TPAP2 3484.21 P^l3GEC¹⁶LR¹⁸ (配列番号 48)

+E⁷⁴AVFPFQPGSVAEVC⁸⁸ITFDQANLTVK" (配列番号 49) 。

この結果より残りの 2組の SS 結合架橋様式は Cys2- Cysl30 および Cysl6-Cys88 であることが同定された。以上より、大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) (約 36%のァセトニトリル濃度で溶出された画分）は 3 組の SS 結合で架橋しており、その架橋様式は Cys42- Cys60、 Cys2-Cysl30 および Cysl6-Cys88であることが判明した。

同様にして約 34%のァセトニトリル濃度で溶出された大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) についても SS結合架橋様式の同定を行ったところ、その架橋様式は Cys2- Cys42、 Cysl6-Cys88 および Cys60- Cysl30 のフォームと Cys2- Cys60、 Cysl6-Cys88 および Cys42- Cysl30 のフォームの混合物であった。実施例 1 4

大腸菌発現 Gall ( 1 — 134) のレクチン活性測定

ガレクチンは一般に動物レクチンと呼ばれる蛋白質のファミリーに属し、 /3 -ガラクシドを含む糖類に結合する。そこで大腸菌発現 GaU ( 1 - 134) がレクチン活性（ -ガラクシド結合活性）を有するかどうかを ^ -ガラクシドをリガンドとするァフィ二ティ一クロマトグラフィーおよび赤血球凝集活性測定法の二つの方法で確認した。

( 1 ) -ガラクシドをリガンドとするァフィ二ティーク口マトグラフィ―

実施例 1 2で取得した大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) を展開溶媒 Aに PBS、展開溶媒 Bに 0.1Mラクトースを含む PBS を用い、 0% Bで平衡化したラクト一スァガロースカラム（ホーネン社製、 05.0 mm X 50 mm ) に、流速 0.5ml/min で 4 °Cにて注入した。注入終了後、 0% Bから 100% B まで 30 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 2ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、素通り画分に分子量 14500Da の Gall ( 1 - 134) が検出された。また同一のサンプルを 5mMDTT で室温、 2時間の還元処理をした後にラクトースァガロースカラムに注入したところ、 Gall ( 1 - 134) は素通リ画分ではなく、約 10mM のラクトース濃度を有する画分に溶出された。この結果より、大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) は /3 -ガラクシド（ラクト一ス）に結合することはできないが、還元処理によリ /3 -ガラクシド結合活性が回復することが確認された。

( 2 ) 赤血球凝集活性の測定

ゥサギ保存血液（コスモバイオ社製） 1ml に 5ml の PBS を加え、 2000G で 5分間遠心後、上清を除いた。この操作を 3回繰り返し、赤血球画分を得た。この赤血球画分 ΙΟΟμ Ι に 4.9ml の PBS を加え、 2%血球浮遊液とした。 96穴タイタープレート（U底）の 1 列目に実施例 1 2で取得した大腸菌発現ヒトガレクチン- 1 (PBSで 50 g/ml に希釈）、 50 1 を入れ、 2列目以降に 0.39 g/ml (各 50μ 1 ) までの 2倍希釈列を作製した。各ゥエルに 2%血球浮遊液を 50^ 1 ずつ分注し、室温で 1 時間放置した。この時、コンカナパリン Α および 5mMDTT で室温、 2時間の還元処理をした大腸菌発現 Gall ( 1 — 134) も同一の希釈系列を作製し、同時に赤血球凝集活性の測定を実施した。その結果、コンカナパリン A および 5mMDTTで室温、 2時間の還元処理をした大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) はいずれも 6.25 g/ml 以上の濃度において赤血球凝集活性が検出されたが、実施例 12で取得した大腸菌発現 Gall ( 1 — 134) (非還元）は 50 iig/mlの濃度においても赤血球凝集活性が検出されなかった。（図 7 ) 以上の i3 -ガラクシドをリガンドとするァフィ二ティ一クロマトダラフィ一および赤血球凝集活性測定法の二つの結果より、実施例 1 2で調製した S S結合を有する Gall ( 1 - 134) はレクチン活性を持たないことが確認された。実施例 1 5

抗 Gall ( 1 — 134) 抗血清の取得と精製

大腸菌発現 Gall ( 1 -134) を抗原としてゥサギに免疫し、ゥサギ抗 Gall ( 1 - 134) 抗血清を取得した。抗原は実施例 1 2に記載した TSKgel SP-5PWカラム（東ソ一社製）によリ精製した大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) を使用した。免疫はゥサギ 2羽を使用し、 Gall ( 1 — 134) と油性アジュバントにてェマルジヨンを作製後、 1羽あたり 20-200 g を約 2ヶ月間にわたり計 6回皮下投与した。免疫終了後、全採血を行い、 1羽あたリ血清約 75ml を取得した。抗原を固相化したプレートを用いた EUSAによる力価測定では、得られた抗血清は 204800 倍希釈まで有意な値を示し、特異性の高い、良好な抗血清が取得された。

取得された抗血清をプロテイン A カラムにょリ精製し、ィムノグロブリン（IgG) 画分を調製した。 10ml の抗血清を 10ml の PBS で 2倍希釈後濾過し、 PBS で平衡化した HiTrap Protein A カラム（フアルマシア社製、 1ml ゲル）に注入した。 20ml の PBSで洗浄後、 5ml の lOOmMグリシン塩酸緩衝液（PH 2.7) で吸着画分を溶出した。この時、予め 500 1 の 1M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0) を分注しておいたチューブを使用した。素通り画分および吸着画分を電気泳動により分析したところ、吸着画分には IgGだけが検出された。一方、素通り画分にも IgGが含まれていたため、素通り画分を再び上記の方法で精製した。電気泳動により分析したところ、 2回目の素通り画分にも IgGが含まれていたため、いま一度上記の方法で精製した。計 3回実施した吸着画分を合わせ（16.5 ml) 、 2L の PBS でー晚透析し、抗 Gall ( 1 - 134) IgG (約 30mg )を取得した。（クーマジ一色素結合法による蛋白定量値）実施例 1 6

抗 Gall ( 1 — 134) IgGカラムの作製

実施例 1 5で取得した抗 Gall ( 1 - 134) IgG を樹脂に固定化し、抗 Gall ( 1 —134) IgGカラムを作製した。 2mg/ml の濃度の抗 Gall ( 1 - 134) IgG溶液、 5ml を 10000カット限外濾過膜（ミリポア社製）を用いて濃縮と同時にカップリングバッファ一（ 0.5M 塩化ナトリウムを含む 0.2M 炭酸水素ナトリウム、 pH8.3) lml に置換した。 HiTrap NHS- activated (フアルマシア社製、 lml ゲル）カラムを 6 ml の lmM塩酸で洗浄後、上記の IgG溶液 lml を注入し、室温で 30分間放置した。その後、カラムを 3ml のカップリングバッファ一で洗浄後、洗浄用バッファ — A (0.5M塩化ナトリゥムを含む 0.5M ェタノ一ルァミン、 pH8.3) および洗浄用バッファー B (0.5M 塩化ナトリウムを含む 0.1M 酢酸ナトリウム、 pH4.0) 6ml ずつで洗浄し、さらに 6ml の洗浄用バッファ一 Aを注入し、室温で 30 分間放置した。その後、カラムを洗浄用バッファー B 、洗浄用バッファ一 A 、洗浄用バッファ一 B、 PBS の順でそれぞれ 6ml ずつ洗浄し、抗 Gall ( 1 —134) I gGカラムの作製が完了した。実施例 1 7

C0S1細胞発現 Gall ( 1 - 134) の精製と SS結合架橋様式の同定

C0S1 細胞で発現し、培養上清中に分泌された GaU ( 1 - 134) の SS 結合架橋様式の同定を行うため、実施例 1 0に記載した還元処理後のラクトースァガロースカラムによる精製法を用いない精製方法で C0S1 細胞培養上清より Gall ( 1 — 134) の精製を行った。実施例 9で取得したヒトガレクチン- lcDNA を組み込んだプラスミド pEFGall を実施例 7 に記載した方法により COS 1 細胞へトランスフエクシヨンし、培養上清 250ml を取得した。これを PBSで平衡化した実施例 1 6で取得した抗 Gall ( 1 — 134) IgG カラムにベリスタルティックポンプ（フアルマシア社製、 P- 1 型）を用いて、 4 °Cにて 0.5ml/ml の流速で注入した。 50ml の PBS で洗浄後、 3ml の lOOmM グリシン塩酸緩衝液（pH 2.7) で吸着画分を溶出した。この時、予め 300μ 1 の 1M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0) を分注しておいたチューブを使用した。吸着画分を電気泳動によリ分析したところ、分子量 14500Da の Gal 1 ( 1 — 134) と思われるバンドが検出されたため、この画分（3.3ml) を次のステップに進めた。抗 Gall ( 1 - 134) IgG カラム吸着画分（3.3ml) を展開溶媒 Aに 0.1%TFA、展開溶媒 Bに 0.1%TFA を含む 80%ァセトニトリルを用い、 40% Bで平衡化した YMC PROTEIN RPカラム（YMC社製 ø 4.6mm x 150mm) に、流速 0.5ml/min で室温にて注入した。注入終了後、 40% Bから 55% Bまで 45 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 0.5ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、約 38%のァセトニトリル濃度を有する画分

(Fr35) に分子量 14500Da の Gall ( 1 — 134) と思われるバンドだけが検出された。そこでこの画分の 0·5μ 1 を用いて実施例 1 3に記載した方法で MALDI-T0F型質量分析計（パ一セプティブ社製、 Voyager Elite) による質量分析を行った。

その結果、このバンドの分子量は 14622. IDaであった。還元状態の Gall

( 1 — 134) の分子量（ 14583.4Da) と比較するとこのバンドは N末端がァセチル化され、 SS結合が形成された Gall ( 1 — 134) であることが判明した。これにより、 C0S1細胞で発現し、培養上清中に分泌された Gall

( 1 一 134) の精製が完了した。

質量分析の結果より培養上清中に分泌された Gall ( 1 - 134) は SS 結合で架橋されていることが推測されたため、その架橋様式の同定を行つた。実施例 1 3に記載した方法に従い、トリプシンおよびリシルェンドぺプチダーゼによる酵素消化を行い、得られたフラグメントの質量分析を行うことにより、それぞれのフラグメントの帰属を行った。その結果、 C0S1細胞で発現し、培養上清中に分泌された Gall ( 1 — 134) の SS 結合架橋様式は Cys42- Cys60、 Cys2-Cysl30 および Cysl6- Cys88 であることが判明した。この架橋様式は、実施例 1 3に記載した大腸菌発現 Gall ( 1 - 134) (約 36%のァセトニトリル濃度で溶出された画分）のそれと同一であった。実施例 1 8

坐骨神経損傷モデル実験

chloral hydrate 麻酔下に、成熟 BALB/c マウス（雌、 3 — 6週令）の坐骨神経を大腿部で露出させ、切断した。切断端中枢側 7mniの部位に forcepts で損傷をカロえた。 osmotic minip卿（Alzet, model2002、 2週間用または model2001、 1 週間用）を背部の皮下に置き、ポンプに接続されたポリエチレン製チューブの中に坐骨神経切断端中枢側を揷入した。 minipump にはあらかじめ生理食塩水で S g/ml の濃度にした Gall(l- 134)溶液を 220μ 1 満たして置き、 1.0 または 0.5^ 1/hの速度で 1 4日間または 7 日間溶液を神経切断端に持続的に送り込んだ。 2週間モデルには損傷部位から切断端まで凍結損傷を追加した。損傷後 7 日目、 1 4 日目に' 4 % paraformaldehyde にて灌流固定を行い、坐骨神経を摘出した後に 2. 5 %ダルタール固定を追加した。オスミウムによる後固定の後にエボン包埋し、超薄切片を作製して電子顕微鏡にて観察した。損傷部位から 6πιπι遠位側、切断端すなわち溶液投与部位から中枢側 1 mmの部位を電子顕微鏡で観察した。

7 日目では、コントロールに比べて Gall(l-134)投与群ではミエリン貪食細胞数の増加と髄鞘再生過程初期像と考えられる再生軸索数の増加傾向がみられ、早期のミエリンの破壊と神経再生の進行を示した。 1 4 日目では、コントロール群では変性ミエリンが多数残存し再生有髄神経がほとんど見られなかった（図 8 B ) 。これに対して、 GallU-134)投与群ではミエリン貪食細胞、変性ミエリンともに減少し、再生無髄神経束の間にうすくリミエリネーシヨン（ remyel i nation) した再生有髄神経が多数みられた（図 8 A) 。これらの所見は、 Gal 1U- 134)投与による損傷神経の再生促進効果を示している。実施例 1 9

末梢神経切断再生実験用コラーゲンゲルシリコンチヤンバーの調製と末梢神経切断再生実験

外径し 5mm, 内径 1mm，長さ 7mmの滅菌シリコンチューブの一端を滅菌ガラスビーズで閉じた。 0°Cの条件下でラットの尻尾よリ抽出した 0.1% 酢酸に溶解されているコラーゲン溶液（0.3%) 0.8ml に 500ng/ml の Gall (卜 134) を 10 μ 1、 10 倍濃度の MEM(GIBC0, Minimum Essential Medium) 0. lml, _PH調整液 (Hepes 0.477gを 0.3N NaOHlOml に溶解） 0. lml を順次加えた。コントロールコラーゲン溶液は Gall(l-134)を加えないで同様に調製した。氷上でシリコンチューブ内にそれぞれのコラーゲン溶液を充填し、 37°Cに加温しコラーゲンをゲル化し、コラーゲンゲルシリコンチャンバ一を作製した。

10-11 週齢 Wistar rat 雄を Pentobarbital (50mg/ml を 0.3ml) にて麻酔し、大腿部を切開し坐骨神経を露出させ、腓骨神経と脛骨神経とに分離した。 Gall (1-134)を含むコラーゲンゲルシリコンチャンバ一とコントロールのコラーゲンゲルシリコンチャンバ一を用意し、左の腓骨神経に GallU-134)入リチヤンバーの開口部を近位側にして平行に並べ両端を糸にて筋肉に固定した。腓骨神経を切断し中枢側切断端をシリコンチューブ内に入れ縫合糸にて神経線維をチューブに固定。切開部を縫合した。同様に右の腓骨神経を切断し、コントロールチャンバ一を装着した。 GaU(l- 134)入リチャンバ一とコント口一ルチヤンバーの装着は 1 匹ごとに左右を入れ替えて行った。 7 日及び 10 日飼育後ラットを Pentobarbital 麻酔し zamboni 固定液にて灌流固定し、移植チャンバ一を摘出した。チューブは 4 %バラフオルムアルデヒドによる固定後 Cryostat にて longi tudinal 或いは crossの凍結切片を作成し、へマトキシリンーェォシン（H E) 染色及び抗ニューロフィラメント（NF)抗体、抗 S100 抗体により免疫染色を行った。 longitudinal 切片の H E 染色像及び抗 S100 抗体、抗 NF 抗体による免疫染色像から、シリコンチューブ内の神経線維切断端から S100 陽性のシュワン細胞の遊走距離並びに N F陽性の再生神経突起の伸長距離を測定した。 cross 切片から NF陽性の再生神経突起数を計測した。

HE 染色の結果から神経切断端からのゲル内へ遊走した細胞の移動距離を測定した。図 9に見られるようにコントロールに比べて Gal 1(1-134) により遊走細胞の移動距離が伸ばされた。表 1 に示すように術後 7 曰目では平均移動距離がコントロールで 0.7 mm に対して Gal 1(1-134)投与群で 1.1mm、術後 10日目ではコントロールで 1.2mmに対して GallU- 134) 投与群で ΐ.9πιπι で、 GallU-134)投与によって細胞遊走が促進された。 S100 陽性のシュワン細胞は遊走細胞の主な細胞で再生先端にまで達しており、図 1 0に見られるように NF 陽性の再生神経突起はそのシュヮン細胞の位置まで伸長していた。またその神経突起数も Gall(l-134)により増加しているのが見られた。この再生神経突起数を切断端から 0.5龍、 1.0mmの 2点の cross section された切片で測定したのが表 2である。切断端から 0.5mm での再生神経突起数の平均値はコントロールで 241 に対して GallU-134)投与群で 882、更（ヒ切断端から 1.0mm の位置ではコントロールで 52 に対して Gal 1(1-134)投与群で 302 と再生神経突起数が有意に増加した。以上の結果 Gall(l-134)投与群では神経切断端からのシュワン細胞を主体とした細胞遊走を促進、同時に再生神経突起の伸長を促進し本数を増加させた。 GallU-134)投与群では in vivo における神経再生促進因子として有用であることが明らかとなった。表 i . 切断端からの遊走細胞哆動距離日数数断端からの遊走細胞平均哆呦距離 (mm) コントノレ day 1 11 0.7 = 0.2

day 10 8 L.2±0.4

Gall(l-134) day" 5 1.1 = 0.1

day 10 1 1.9±0.ό unpaired Student's t-test dav7:p<0.00l dayl0:p<0.0l

表 2. ニューロフィラメント陽性神経突起数切断端からの距雜

test number 0.5 mm 1.0mm コントローノレ No.134 126 50

No.135 173 44 No.158 489 167 No.159 157 41 No.161 242 68 No.164 395 0 No.182 108 0 コント口一ノレ平均 241 ±135 52 ±52

Gall(l-134) No.139 894 000

No.160 444 126 No.163 387 86 No.171 1374 795 No.174 432 137 No.175 1766 114

Gall(l-134) 平均 882 ±526 302 ±273 unpaired Student's t-test O.omm: p<0.0l i.0mm:p<0.05 実施例 2 0

グルタチオン一 S—トランスフェラ一ゼ（ GST) とヒトガレクチン- 1 (ァミノ酸 1 一 134) の融合蛋白質（以下、この融合蛋白質を「GST—Gall ( 1 一 134) 」と称す）の大腸菌発現用べクタ一の構築

ダルタチオン一 S —トランスフェラーゼ（ GST) との融合タンパク発現ベクターである pGEX— 5X— 2 (フアルマシア社製）によって、 GST— Gall ( 1— 134) を発現させるために、次のことを行った。まず、 pEFGall を铸型として、 2本の P C R用プライマ一 HLEG11,HLEG13 を用いて PCR を行った（94°C 5分間の後に、 94°C 30秒間 60°C 30秒間 72°C 1 分間の合成条件で 25回の反応を行い、さらに 72°Cで 5分間反応させる）。増幅された断片を BamHI と Notl で消化後 0.8%のァガロースゲルで泳動し、約 420bp の大きさの断片を回収してプレップ一 A—ジーン DNA 精製キットで精製し、 BamHI, Notl で消化した pGEX— 5X— 2 に揷入（宿主は E. coli DH5aを使用した）した。正しいヒトガレクチン- 1 cDNA の塩基配列（ベクタ一の BamHI から Notl までの塩基配列を配列番号 8に示す）を有するクローン pGEXGall ( 1— 134) を、塩基配列の解析により選択し、これを GST— Gall ( 1- 134) 発現用の形質転換体とした。ここで用いた P C R用プライマーの配列は以下の通りである：

HLEG11 ： 5 ' - GAGAGAGGATCCCCATGGCTTGTGGTCTGGTCGC- 3 ' (GENBANK ACCESSION NO. J04456の 50— 69の 5 '端に BamHI サイトを付加し、インフレームで GST- Tagにつながるようにした；配列番号 50) ；

HLEG13： 5 ' -AGAGTGCGGCCGCTTATCAGTCAAAGGCCACACATTTG- 3 ' (GENBANK ACCESSION NO. J04456 の 436— 457 の相補鎖の 5 '端に Notl サイトを付加した；配列番号 51) 。

この発現プラスミドは、 GST タンパクに続いてファクタ一 Xa 認識配列、及びヒトガレクチン- 1 (アミノ酸 1 — 134) をコードする配列を含んでいる [ファクタ一 Xa 認識配列からヒトガレクチン- 1 (アミノ酸 1 — 134) に至るアミノ酸配列を配列番号 9 に示した。 ]。実施例 2 1

ダルタチオン一 S — トランスフェラ一ゼ（GST) とアミノ酸 2 (Cys)を Ser に変換したヒトガレクチン- 1 (アミノ酸 1 — 134) の融合蛋白（以下、この蛋白質を「 GST—Gall (2/Ser) | と称す）の大腸菌用発現べクターの構築

ダルタチオン一 S — トランスフェラーゼ（GST) との融合タンパク発現べクタ—である pGEX— 5X— 2 (フアルマシア社製）によって、 GST- Gall (2/Ser) を発現させるために、次のことを行った。まず、 pGEXGall

(1-134) を錡型として、 2本の PCR 用プライマ一 HLEG15, HLEG23 を用いて PCR を行った（94°C 5分間の後に、 94°C 30秒間 55°C 30秒間 Z 72°C 1分間の合成条件で 25 回の反応を行い、さらに 72°Cで 5分間反応させる）。増幅された断片を BamHI と Notl で消化後 2 %のァガロースゲルで泳動し、約 420bp の大きさの断片を回収してプレップ- A —ジーン DNA 精製キットで精製し、 BamHI、 Notl で消化した pGEX— 5X— 2 に揷入（宿主は E.coli DH5 を使用した）した。塩基番号 5 6 (GENBANK ACCESSION NO. J04456) が塩基番号 5 8 (GENBANK ACCESSION NO. J04456) が C に変換されたヒトガレクチン一 1 cDNA の塩基配列を有するクロ一ン pGEXGall (2/Ser) (ベクタ一の BamHI から Notl までの塩基配列は 15位の T が A、 17位の T が C に変わっている以外は配列番号

8に同じ）を、塩基配列の解析によリ選択し、これを GST— Gall (2 /Ser) 発現用の形質転換体とした。ここで用いた P C R用プライマーの配列は以下の通りである：

HLEG15 ： 5， - GAGAGAGGATCCCCATGGCTAGCGGTCTGGTCG- 3 ' (配列番号 52 ; GENBANK ACCESSION NO. J04456 の 50— 68 の 5 '端に BamHI サイトを付加し、インフレームで GST-Tag がつながるようにした。また、塩基番号 56を A、塩基番号 58 を Cに変換した。）；

HLEG23 ： 5 ' - AGAGAGCGGCCGCTTATCAGTCAAAGGCCACACATTT - 3 ' (配列番号 53 ； GENBANK ACCESSION NO. J04456 の 437 - 457 の相補鎖の 5 '端に NoU サイトを付加した）。この発現プラスミドは、 GST タンパクに続いてファクタ一 Xa 認識配列、及び変異型ヒトガレクチン- 1 をコードする配列を含んでいる（ファクタ一 Xa 認識配列から変異型ヒトガレクチン- 1 に至るアミノ酸配列は 10位の Cys力 Serに変わっている以外は配列番号 9に同じである）。実施例 2 2

グルタチオン一 S— トランスフェラーゼ（GST) と全ての Cys を Ser に変換したヒトガレクチン- 1 (アミノ酸 1 — 134) の融合蛋白（以下、この蛋白質を「 GST— Gall (all/Ser) 」と称す）の大腸菌用発現べクタ一の構築

ダルタチオン一 S — トランスフェラ一ゼ（GST) との融合タンパク発現べクタ—である pGEX— 5X-2 (フアルマシア社製）によって、 GST— Gall (all/Ser) を発現させるために、次のことを行った。ヒトガレクチン内には、 6つの Cys が存在するが、まず配列番号 1 の 130位の Cys を Ser に変換するため、 2本の合成オリゴマ一 HLEG21，HLEG22 をァ二一ル（99°C 5min/80°C δπιίη/ΤΟ'Ο 5min/60°C 5min/50°C 5min/40°C 5min/30°C 5min) させ、 EcoRI, Notl で消化した pGEX— 5X— 2 に挿入 (宿主は E. coli DH5 を使用した）した。ヒトガレクチン- 1 cDNA の塩基番号 366 ( GENBANK ACCESSION NO. J04456) に位置する EcoRI から下流の塩基配列のうち、塩基番号 440 ( GENBANK ACCESSION NO. J04456) の Tが Aに、塩基番号 442 ( GENBANK ACCESSION NO. J04456) の Tが C に変換された配列を有するクローン pGEXGalUal 1/Ser— 3') (EcoRI サイトから NoU サイトまでを配列番号 1 0 に示す）を、塩基配列の解析によリ選択した。ここで用いた合成ォリゴマ一の配列は以下の通リである：

HLEG21： 5 ' -

CAAGATCAAAAGCGTGGCCTTTGACTGATAAGC- 3 ' (配列番号 54 ; GENBANK ACCESSION NO. J04456の 366— 457の 3'端に No 11 サイトを付加した。また、塩基番号 440の Tは A、 442の Tは Cに変更。）

HLEG22： 5 ' —

ATGGCCTCCAGGTTGAGGCGGTTGGGGAACTTG- 3 ' (配列番号 55； GENBANK ACCESSION NO. J04456の 370— 457の相補鎖の 5 '端に Not〖サイトを付加した。また、塩基番号 440のアンチセンスである Aは T、 442のアンチセンスである Αは Gに変更。）

残りの 5 つの Cys を Ser に変換するため、次のことを行った。 pGEXGall (卜 134) 2ngをテンプレートとし、合成したプライマ一（ HLEG16 及び HLEG18) 各 5pmol を用いて PCR を行なった。 Ampl iTaq^TM DNA Polymerase ( パ一キンエルマ一社製）を使用して、 GeneAmp^TM PCR System 2400 (パ一キンエルマ一社製）により 50^ 1 の容量で PCR (94°C 5 分間の後に、 94°C 30秒間 72°C 2分間の合成条件で 25回の反応を行い、さらに 72°Cで 5 分間反応させる）を行った。また、 pGEXGall (卜 134) を铸型として、合成したプライマー（ HLEG17及び HLEG20) 各 5pmol を用いて同条件で PCR を行なった。上記 2種類の反応液を混合した後 PCR 反応（94°C 30秒間 72°C 2分間の合成条件で 5回）を行い、この反応液 Ι μ ΐ をテンプレートとして合成したプライマ一（ HLEG15 及び HLEG19) 各 20pmol を用いて PCR ( 100 1 の容量で、 94°C 30秒間 Z55°C 30秒間ノ 72°C 1分間の合成条件で 25回の反応を行い、さらに 72°Cで 5 分間反応させる）を行った。増幅された断片を EcoRI と BamHI で消化後 2 %のァガロースゲルで泳動し、約 330bp の大きさの断片を回収してプレップ一 A —ジーン DNA 精製キットで精製し、 EcoRI, BamHI で消化した pGEXGall(all/Ser— 3')に揷入（宿主は E. col i DH5 を使用した）した。全ての Cys を Ser に変換したヒトガレクチン- 1 の塩基配列を有するクローン pGEXGall (al 1/Ser) (ベクターの BamHI から Notl までの塩基配列は 15位の Tが A、 17位の T力 C、 57位の T力 A、 135位の Tが 189 位の Τが Α、 273位の Τ が 399位の Τ 401 位の Τ 力（：に変わつている以外は配列番号 8 に同じ）を塩基配列の解析により選択した。ここで用いた P C R用プライマーの配列は以下の通りである：

HLEG16： 5 ' -

( 配列番号 56； GENBANK ACCESSION NO. J04456の 50— 105。また、塩基番号 56 を A、塩基番号 58 を塩基番号 98 を Aに変換した。）； HLEG17： 5 ' —

C一 3 ' ( 配列番号 57； GENBANK ACCESSION NO. J04456の 171— 235。また、塩基番号 176 を A、塩基番号 230を Aに変換した。）；

HLEG18： 5 ' -

T一 3 ' ( 配列番号 58； GENBANK ACCESSION NO. J04456の 171— 235の相補鎖。また、塩基番号 176のアンチセンスの Aを T、塩基番号 230のアンチセンスの Α を Τに変換した。）；

HLEG19： 5 ' - AACTTGAATTCGTATCCATCTG- 3 ' (配列番号 59 ; GENBANK ACCESSION NO. J04456の 354— 375の相補鎖。）；

HLEG20： 5，一

C- 3 ' (配列番号 60 ; GENBANK ACCESSION NO. J04456の 311— 375の相補鎖。また、塩基番号 314のアンチセンスの Aを Tに変換した。）。

この発現プラスミドは、 GST タンパクに続いてフ了クタ一 Xa 認識配列、及び全ての Cys を Ser に変換したヒトガレクチン -1 をコードする配列を含んでいる（ファクター Xa 認識配列から変異型ヒトガレクチン- 1 に至るァミノ酸配列は、すべての Cys Ser に変わった以外は配列番号 9に同じである）。実施例 2 3

GST 融合蛋白質（ GST— Gal l (1- 134) ) の大腸菌での発現、ファクタ — Xa による GST 部分の除去、 Glyl leProMet (配列番号 61) が N末に付加している Galin-134)[GIPM- Gall(l- 134)1の精製

実施例 20で得られたクローンを、アンピシリン 50 μ g/m 1 を含む L B寒天培地上に塗布し、 37°Cで一晩培養してコロニーを形成させ、このコロニ一 1個をァンピシリン 50 ig/nil を含む L B培地 50ml で振盪培養し、この培養液を初発の 0D_6QQが 0.2 となるようにアンピシリン 50 g/ml を含む L B培地 1000ml に加え、 0D_6(H)が 0.5— 0.6 に至るまで 37°Cで振盪培養した。次いで最終濃度が、 0.1 mM になるように I P T G (イソプロピルチオガラクトシド）を添加し、さらに 3時間振盪培養して、 GST -Gall (1- 134) の発現を誘導した。

菌体培養液 1L を 10000Gで 30分の遠心分離を行い、 GST- Gall ( 1 - 134) 融合蛋白質発現菌体ぺレットを得た。ペレットを 20ml の PBS に懸濁し、氷冷下にてソニケ一シヨンを行い、菌体を破砕した。菌体破砕液を 10000Gで 30分の遠心分離し、上清中に可溶性蛋白として GST- Gall

( 1 - 134) 融合蛋白質を回収した。回収した上清を PBS で平衡化したグルタチオン- Sepharose4B カラム（フアルマシア社製 03cm x 5cm ) に注入した。展開溶媒を ImM 塩化カルシウム、 lOOmM NaCl を含む 50mM トリス塩酸緩衝液（PH 8.0)に換えて十分に洗浄した後、フアクター Xa、 400 Unit をカラムに注入し、室温で一晚放置した。一晩放置後、ファクタ一 Xaによリ切断された GIPM- Gall ( 1一 134) を ImM塩化カルシゥム、 lOOmM NaCl を会む 50mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)にて lml/min の流速で溶出した。溶出液を 3ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行い、分子量 14500Da の GIPM-Gall ( 1 — 134) と思われるバンドが検出された画分（12ml) を次のステップに進めた。この画分（12ml) を限外濾過ユニット（アミコン社製； YM 3膜、直径 25mm) で濃縮し、さらに 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)にバッファ一交換した。（最終液量 3ml) これを展開溶媒 Aに 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)、展開溶媒 Bに 500mM NaCl を含む 20mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)を用い、 0% Bで平衡化した Shodex IEC DEAE825カラム（昭和電工社製、日本国； φ 8 mm x 7.5cm) に、流速 0.5m tniri で室温にて注入した。注入終了後、 0% Bから 60% Bまで 60 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を lmi ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、約 80πιΜ の NaCl 濃度を有する画分に分子量 14500Da の GIPM-Gall ( 1一 134) と思われるバンドが検出されたため、この画分（1ml) を次のステップに進めた。この画分（1ml) を展開溶媒 Aに 0.1%TFA、展開溶媒 Bに 0,085%TFA を含む 80°ァセトニトリルを用い、 20% Bで平衡化した TSKgei Phenyl -5PW RPカラム（東ソ一社製、日本国； ø 4.6mm X 7.5cm)に、流速 0.5nU/min で室温にて注入した。注入終了後、 20% Bから 80% Bまで 40 分の直線濃度勾配で展開した。溶出液を 1ml ずつ分画し、各画分の電気泳動による分析を行ったところ、約 30%のァセトニトリル濃度を有する画分に分子量 500Da の GIPM-Gall ( 1 — 134) と思われるバンドだけが検出され精製は完了した。そこでこのバンドが GIPM-Gall ( 1 — 134) であることを確認するため、プロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社製、 492型）を用いて N 末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、次に示す N末端アミノ酸配列が検出された（Xは未同定である）：

Glyl leProMetAlaXGlyLeuValAlaSerAsnLeuAsnLeu (配列番号 62) 。この配列は設計通リの GIPM-Gall ( 1 - 134) の N 末端ァミノ酸配列に —致しておリ、 TSKgei Phenyl -5PW RP カラムにより精製した蛋白が GIPM-Gall ( 1 — 134) であることが確認された。

同様にして実施例 2 1で得られたクローンを大腸菌で発現し、 GST— Gall (2/Ser) を取得後、ファクター Xaにより切断し、 2位の Cysが Ser に置換された GIPM-Gall[GIPM- Gall(2/ser)と称す]を取得した。

同様にして実施例 2 2で得られたクローンを大腸菌で発現し、 GST— Gall (al 1/Ser) を取得後、ファクタ一 Xa により切断し、 6 個の Cys 全てが Ser に置換された GIPM- Ga [GIPM- Gall(all/ser)と称す]を取得した。配列表フリ一テキスト配列番号 10 pGEXGall(al 1/Ser- 3，）の EcoRI- NoU

配列番号 11 Notl配列を含む c DNA合成用プライマー

配列番号 12 EcoRI 配列の付加用アダプタ一

配列番号 13 配列番号 2のヌクレオチド 52— 71 に相補的な配列配列番号 14 配列番号 2のヌクレオチド 33—51 に相補的な配列配列番号 15 PEF18Sの配列決定用プライマ一

配列番号 16 配列番号 3のヌクレオチド 118— 137に相補的な配列配列番号 Π 配列番号 3のヌクレオチド 36— 55に相補的な配列配列番号 18 M13逆方向プライマ一

配列番号 19 M13 -20)順方向プライマー

配列番号 20 配列番号 4のヌクレオチド 64— 83に相補的な配列配列番号 21 T7ブライマー

配列番号 25 ジーンバンク受託番号 J04456のヌクレオチド配列 15— 34 配列番号 26 ジーンパンク受託番号 J04456のヌクレオチド配列 28— 47 配列番号 27 ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 472— 491 に相補的な配列

配列番号 28：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 463— 482 に相補的な配列で、かつその 5 ' 側に Notl部位をもつ配列

配列番号 29：ヒトガレクチン一 1 c MA を含む pEFGll クローンを得るためのプライマー

配列番号 30：ヒトガレクチン一 1 c DNA を含む pEFGll クローンを得るためのプライマー

配列番号 31 ：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 436— 457 に相補的な配列で、かつその 5 ' 側に BamHI部位をもつ配列

配列番号 32：ジーンバンク受託番号 J04456のヌクレオチド 50— 69で、かつその 5 ' 側に Not I 部位をもつ配列

配列番号 50：ジーンバンク受託番号 J04456のヌクレオチド 50— 69で、かつその 5 ' 側に BamHI部位をもつ配列

配列番号 51 ：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 436— 457 に相補的な配列で、かつその 5 ' 側に Notl部位をもつ配列

配列番号 52：ジーンバンク受託番号 J04456のヌクレオチド 50— 68で、かつその 5 ' 側に BamHI部位をもつ配列

配列番号 53：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 437— 457 に相補的な配列で、かつその 5 ' 側に Notl部位をもつ配列

配列番号 54 : ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 366— 457 で、かつその 3 ' 側に Notl部位をもつ配列

配列番号 55：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 370— 457 に相補的な配列で、かつその 5 ' 側に Notl部位をもつ配列

配列番号 56：ジーンバンク受託番号 J04456のヌクレオチド 50- 105で、かつその 56位、 58位および 98位がそれぞれ A、 Cおよび A に変換されている配列

配列番号 57 : ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 171— 235 で、かつその 176位および 230位がそれぞれ Aおよび Aに変換されている配列

配列番号 58：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 171— 235 に相補的な配列

配列番号 59 : ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 354— 375 に相補的な配列

配列番号 60：ジーンバンク受託番号 J04456 のヌクレオチド 311-375 に相補的な配列で、かつその 314位の Aが Tに置換されている配列配列番号 61 ： GallU-134)の N末端に付加されたァミノ酸配列

配列番号 62 : Gall(l- 134)の N末端配列

本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願の全体を参考として本明細書中にとり込むものとする。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 1 に示されるァミノ酸配列を有するガレクチン一 1又はその誘導体を有効成分として含む、神経損傷、神経変性、神経移植時機能低下を含む神経障害の治療剤。

2 . 医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とする請求項 1 に記載の治療剤。

3 . ガレクチン— 1 又はその誘導体が、神経突起の再生、神経組織の修復等の神経再生促進作用をもつことを特徴とする請求項 1又は 2に記載の治療剤。

4 . ガレクチン一 1 又はその誘導体がレクチン活性をもつことを特徴とする請求項 1 〜 3のいずれかに記載の治療剤。

5 . ガレクチン一 1 又はその誘導体がレクチン活性をほとんど又は全くもたないことを特徴とする請求項 1〜 3のいずれかに記載の治療剤。

6 . 誘導体が、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列において 1 個以上のアミノ酸が置換、欠失、揷入及び Z又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、神経再生促進作用を有することを特徴とする請求項 1 〜 5のいずれかに記載の治療剤。

7 . 誘導体が、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列とアミノ酸レベルで 8 0 %以上の相同性を有することを特徴とする請求項 1 〜 5のいずれかに記載の治療剤。

8 . ガレクチン一 1 又はその誘導体の N末端がァシル化されていることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれかに記載の治療剤。

9. N末端がァセチル化されていることを特徴とする請求項 8に記載の治療剤。

1 0. ガレクチン一 1又はその誘導体が水溶性ポリマーと共有結合されていることを特徴とする請求項 1〜 9のいずれかに記載の治療剤。

1 1 . 水溶性ポリマーがポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項 1 0に記載の治療剤。

1 2. ガレクチン— 1又はその誘導体が、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列中の 2番目（Cys2) 、 16番目（Cysl6)、 42番目（Cys42)、 60番目 (Cys60)、 88 番目（Cys88)及び 130 番目（Cysl30)のシスティン残基のうち少なくとも 16 番目のシスティン（Cysl6)と 88 番目のシスティン (Cys88)の間でジスルフィド結合を形成していることを特徴とする請求項 1〜 3、 5〜 1 1のいずれかに記載の治療剤。

1 3. ガレクチン一 1又はその誘導体が、（1) Cysl6-Cys88, Cys2-Cysl30 及び Cys42-Cys60;文は（2)Cysl6-Cys88, Cys2- Cys60及び Cys42-Cysl30；又は（3) Cysl6-Cys88, Cys2-Cys42 及び Cys60- Cysl30；のいずれかの組の各システィン間にジスルフイド結合を形成していることを特徴とする請求項 1 2に記載の治療剤。

1 4. ガレクチン— 1 又はその誘導体が、前記（1) 、 (2) 及び（3) のうち少なくとも 2つの組の混合物からなることを特徴とする請求項 1 3に記載の治療剤。

1 5. 前記混合物が前記（1) を 50%以上含有することを特徴とする請求項 1 4に記載の治療剤。

1 6. 他の神経栄養因子或いは、該因子を含む傍神経細胞又は細胞外マトリックスをさらに含むことを特徴とする請求項 1 〜 1 5のいずれかに記載の治療剤。

1 7. 前記細胞外マトリックスが、ラミニン、コラーゲン、フイブロネクチン又はスロンボスボンディンであることを特徴とする請求項 1 6に記載の治療剤。

1 8. 前記傍神経細胞が、シュワン細胞、線維芽細胞、サテライト細胞、マクロファージ又はグリア細胞であることを特徴とする請求項 1 6に記載の治療剤。

1 9. 生体適合性材料からなるチューブ内に封入されていることを特徴とする請求項 1 〜 1 8のいずれかに記載の治療剤。

2 0. 配列番号 1 に示されるァミノ酸配列又はその配列とアミノ酸レべルで 9 0 %以上の相同性のアミノ酸配列を有し、且つ、その配列中の 2 番目（Cys2) 、 16 番目（Cysl6)、 42 番目（Cys42)、 60 番目（Cys60)、 88 番目（Cys88)及び 130 番目（Cysl30)のシスティン残基のうち少なくとも 16 番目のシスティン（Cysl6)と 88 番目のシスティン（Cys88)の間でジスルフィド結合を形成している、神経再生促進作用を有する蛋白質。

2 1 . ( 1) Cysl6-Cys88, Cys2-Cysl30 及び Cys42-Cys60；又は（2) Cysl6-Cys88, Cys2-Cys60 及び Cys42-Cysl30 ；又は（ 3 ) Cysl6- Cys88, Cys2-Cys42 及び Cys60- Cysl30；のいずれかの組の各システィン間にジスルフィド結合を形成していることを特徴とする請求項 2 0に記載の蛋白質。

2 2 . 前記（ 1 ) 、（2) 及び（3 ) のうち少なくとも 2つの組の混合物からなることを特徴とする請求項 2 1 に記載の蛋白質。

2 3 . 前記（1 ) を 50 %以上含有することを特徴とする請求項 2 2に記載の蛋白質。

2 4 . N末端がァシル化されていることを特徴とする請求項 2 0 〜 2 3 のいずれかに記載の蛋白質。

2 5 . N末端に M e t - ² L y s ¹又は M e t ¹ が付加されていることを特徴とする請求項 2 0〜 2 3のいずれかに記載の蛋白質。

2 6 . 水溶性ポリマ一と共有結合されていることを特徴とする請求項 2 0〜 2 3のいずれかに記載の蛋白質。

2 7 . 水溶性ポリマーがポリェチレングリコールであることを特徴とする請求項 2 6 に記載の蛋白質。

2 8 . 請求項 2 0〜 2 7のいずれかに記載の蛋白質を含有する物質を、前記蛋白質に対する抗体を結合したァフィ二ティ一カラムに通して前記蛋白質を吸着し、次いでそれらを溶出し、必要に応じてさらに酸化処理にかけることを含む、前記蛋白質の製造方法。