DE69832402T2 - Erzeugung von hämatopoietischen zellen aus multipotenten neuronalen stammzellen - Google Patents

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Description

  • Prioritätsbegründende Anmeldungen
  • Es wird die Priorität der U.S.-Anmeldung Nr. 09/100,679, eingereicht am 19. Juni 1998, und der vorläufigen U.S.-Anmeldung Nr. 60/060,289, eingereicht am 29. September 1997, in Anspruch genommen.
  • Gebiet der Erfindung
  • Das Gebiet der Erfindung ist auf die Verwendung von aus neuralen Stammzellen gewonnenen Zusammensetzungen für die Reparatur, Rekonstitution oder Augmentation eines hämatopoetischen (blutbildenden) Systems eines Säugers gerichtet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen und deren Nachkommen durch Knochenmarktransplantationen zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems wird zur Behandlung verschiedener blutbedingter Erkrankungen und Störungen wie aplastische Anämie, Immunschwächen und mehreren Arten von Krebs, darunter Lymphome und Leukämien (siehe Bericht in Lu et al. Critical Rev. Onco/Hematol. 22: 61–78 (1996)), eingesetzt. Die Knochenmarktransplantation wird sehr häufig in dem Versuch eingesetzt, im Anschluss an ein Einwirken von myeloablativen Mitteln, zum Beispiel nach Strahlentherapie oder Chemotherapie bei der Behandlung verschiedener Krebsarten, die hämatopoetische Funktion wiederherzustellen. Neben der Zerstörung von Krebs können diese Therapien auch zu Myelosuppression oder Myeloablation führen, was wiederum zu Infektion, Blutungsstörungen und anderen Komplikationen führen kann. Neuere Schätzungen deuten darauf hin, dass der Bedarf an Transplantation von aus Knochenmark gewonnenen hämatopoetischen Stammzellen bei einer Geschwindigkeit von 20% pro Jahr wächst und der Markt für das Produkt bei etwa $500 Millionen pro Jahr liegt (Strickland, D. Bioworld Today 8(14): 1).
  • Leider ist für Patienten der Einsatz von Knochenmark-Transplantation als Therapie sehr eingeschränkt. Die Verwendung von hämatopoetischen Zellen als Quelle von Zellen bei der Behandlung blutbedingter Störungen und Erkrankungen ist mit mehreren Nachteilen behaftet. Der Erfolg einer allogenen Transplantation hängt für gewöhnlich davon ab, einen Spender zu finden, der mit dem Rezipienten histokompatibel und bereit ist, sich dem schmerzhaften und zeitaufwändigen Knochenmarkspendeprozess zu unterziehen. Genetische Inkompatibilität kann zu zwei häufigen und potentiell letalen Komplikationen führen. Zum einen wird zum Mindern der Möglichkeit einer Wirt-Transplantat-Reaktion das Immunsystem des Patienten durch die Verwendung von immunsuppressiven Arzneimitteln beeinträchtigt, was den Patienten sehr anfällig für eine Infektion macht. Zum anderen greifen die transplantierten Knochenmarkzellen nach Festsetzen manchmal den Patienten in einer Transplantat-Wirt-Reaktion an. Zusammen stellen diese beiden Faktoren die Hauptursachen für Sterbefälle und Erkrankungshäufigkeit von Patienten bei nicht-autologen Knochenmarktransplantaten dar.
  • Optional zu einer allogenen Transplantation kann manchmal unter der Voraussetzung, dass der Patient gesund genug ist, um den Eingriff zu überstehen, und das Mark brauchbar ist, das patienteneigene Knochenmark geerntet und zur späteren Verwendung aufbewahrt werden. Wenngleich die Verwendung eines solchen autologen Systems im Allgemeinen die Gefahr einer mangelnden genetischen Übereinstimmung ausschließt, bestehen dennoch schwere Risiken aufgrund einer möglichen nicht feststellbaren Verunreinigung mit bösartigen Zellen. Die zuverlässige Feststellung und Eliminierung von transformierten Knochenmarkzellen muss erst verwirklicht werden. Ein weiterer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass nur eine beschränkte Menge an Knochenmarkzellen, die das hämatopoetische System vollständig wiederherstellen können, von einer Person geerntet werden können.
  • Es wurden große Anstrengungen unternommen, Ex-vivo-Kultursysteme für hämatopoetische Stamm- und Nachkommenzellen zum Zweck der Erzeugung einer ausreichenden Menge an Zellen für Transplantationszwecke aufzubauen. Die Beschaffung ausreichender Mengen von hämatopoetischen Stammzellen, entweder durch Knochenmarkbiopsie oder aus anderen Quellen, ist aber eine Beschränkung bei der Verwendung dieses Gewebes bei mit dem hämatopoetischen System verbundenen Therapien. Bekannte Systeme erfordern komplexe Kulturbedingungen und langwierige Zelltrennungsschritte und führen zu einer nur beschränkten Vermehrung der Anzahl hämatopoetischer Stammzellen. Siehe zum Beispiel U.S. Pat. Nr. 5,646,043 für Emerson et al. Der größte Nachteil ist die fehlende Fähigkeit, die Stammzellen in vitro unter festgelegten Kulturbedingungen über einen längeren Zeitraum sequentiell zu passagieren, um die Zahl der für die Transplantation verfügbaren funktionsfähiger Zellen zu vermehren. (Amos & Gordon, oben; Lu, et al., oben). Folglich besteht ein ungebrochener Bedarf, bei Therapien, die die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems betreffen, autologe Stammzellen entweder wiederholt zu ernten oder kompatible Spender anzuwerben.
  • Aufgrund der oben erwähnten Komplikationen wurden andere Quellen für Stammzellen für eine hämatopoetische Rekonstitution gesucht. Es wurde über Studien zum Einsatz von fötalen Leberzellen, neonatalen Milzzellen oder Thymuszellen berichtet. (Amos & Gordon, oben; Lu et al., oben). Die mit dem Einsatz dieser Zellarten verbundenen ethischen Probleme machen ihre gewerbliche Verwendung weniger attraktiv. Die Möglichkeit des Erntens und Kryokonservierens von Nabelschnurblut wird derzeit untersucht und kann ein annehmbareres Mittel zum Beschaffen von Zellen für spätere Verwendung bieten (Broxmeyer et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 3828). Bisher haben sich aus Nabelschnurblut gewonnene Zellen aber nur als fähig erwiesen, das hämatopoetische System von Kindern erfolgreich neu zu bevölkern (Amos & Gordon, oben). Die jüngste Identifizierung von peripheren Blutnachkommenzellen (PBPC) mit Knochenmark neubevölkernden Fähigkeiten hat den Weg für neue Untersuchungen zur Verwendung von PBPC für die Transplantation geöffnet (diskutiert in Lu et al., oben). Das Ernten dieser Zellen würde potentiell den Bedarf an Knochenmarktransplantaten ersetzen. Bei diesem System sind aber mehrere Nachteile ersichtlich: 1) das geerntete Blut kann verunreinigt sein, 2) die Häufigkeit der Erkrankung durch Transplantat-Wirt-Reaktion ist immer noch sehr hoch, 3) zum Sammeln ausreichender zirkulierenden Stammzellen für eine vollständige hämatopoetische Rekonstitution sind viele Leukapherese-Durchläufe erforderlich und 4) die gesammelten Stammzellen können nicht über lange Zeiträume in einem undifferenziertem Zustand gehalten werden.
  • Aus dem Vorstehenden wird offensichtlich, dass Alternativen zu den vorliegenden Verfahren zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems eines Patienten erforderlich sind.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen an die Hand zu geben, die Vorläuferzellen enthalten, die mühelos erhalten und zur Erzeugung von hämatopoetischen Zellen zur Verwendung bei der xenogenen, allogenen oder autologen Transplantation verwendet werden können. Eine Aufgabe der Erfindung besteht ferner darin, Zusammensetzungen an die Hand zu geben, die mit Hilfe autologer Zellen erzeugt werden können, die einem Patienten während oder im Anschluss an eine myeloablative Therapie zur Behandlung von blutbedingten Störungen wie Lymphomen und Leukämien, Sichelzellenkrankheit, Osteopetrose usw. transplantiert werden können, wodurch das Risiko des Transplantierens von erkrankten oder krebsartigen Zellen vermieden und die Probleme des Stands der Technik mit Transplantatabstoßungen überwunden werden.
  • Die vorliegende Erfindung verwirklicht diese Ziele durch Bereitstellen von Zusammensetzungen, die multipotente neurale Stammzellennachkommen enthalten, die zur Erzeugung hämatopoetischer Zellen verwendet werden können. Dadurch gibt die Erfindung eine neue medizinische Verwendung von multipotenten neuralen Stammzellennachkommen zur Erzeugung von Zusammensetzungen für die Augmentation, Behandlung oder Veränderung des hämatopoetischen Systems eines Patienten an die Hand. Ein Verfahren für das Erzeugen hämatopoetischer Zellen aus multipotenten neuralen Stammzellennachkommen eines Säugers umfasst das Setzen der multipotenten neuralen Stammzellennachkommen in eine Umgebung, beispielsweise das Kreislaufsystem eines Patienten, die die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen anregt, hämatopoetische Zellen zu erzeugen. Das Verfahren kann zur Behandlung eines Patienten verwendet werden, der sich einer myeloablativen Therapie, beispielsweise Strahlentherapie, Chemotherapie oder einer Kombination beider, unterziehen wird oder bereits unterzogen hat und daher unterdrückte oder dezimierte endogene hämatopoetische Stammzellen hat. Das Verfahren kann auch zur Behandlung eines Patienten eingesetzt werden, der unter einem genetischen Defekt leidet, der hämatopoetische Zellen beeinträchtigt, indem multipotente neurale Stammzellennachkommen transplantiert werden, die von einem Spender mit normalen hämatopoetischen Zellen erhalten wurden, oder indem genetisch modifizierte Zellen verabreicht werden, die für den Patienten autolog, allogen oder xenogen sein können. Ferner kann das Verfahren zur Behandlung normalern Patienten verwendet werden, um diesen ein supranormales hämatopoetisches System zu geben oder ihnen ein hämatopoetisches System mit gegenüber dem Normalzustand zusätzlichen Eigenschaften oder Funktionen zu geben.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1: Direkte Darstellung von transplantierten multipotenten neuralen Stammzellennachkommen (NSC) mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie. Milzzellensuspensionen einer Kontrollgruppe nicht bestrahlter ROSA26 und Balb/c (Reihen 1–3) sowie von bestrahlten Rezipientenmäusen (Reihen 4–6) wurden auf Deckgläser mit einer Cytospin zentrifugiert. Die Zellen wurden für H-2Kb (rot) und einen der hämtopoetischen phänotypischen Marker (grün) doppelmarkiert. Die doppelmarkierten Zellen zeigten sich gelb und zeigen sich in 1 als dunkelgraue oder schwarze Zellen. Die doppelmarkierten Zellen fehlten in der Milz von nicht bestrahlen Balb/c-Mäusen (Reihe 1) und in der Milz von EBSS-injizierten Kontrolltieren (Reihe 2). Eine große Menge von doppelmarkierten Zellen fand sich in den nicht bestrahlen ROSA26-Kontrolltieren (Reihe 3) sowie in Tieren, denen ROSA-Knochenmark (Reihe 4) oder embryonale NSC (Reihe 5) oder adulte NSC (Reihe 6) injiziert worden war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen die Fähigkeit haben, das beeinträchtigte hämatopoetische System wieder zu bevölkern. (Vergr. 630fach).
  • 2A2F: Clonogene In-vitro-Tests von Knochenmark, das aus Tieren gewonnen wurde, die entweder embryonale oder adulte neurale Stammzellen erhalten hatten, lassen neurale Stammzellentransplantat-Akzeptanz im Mark erkennen. Zur Ermittlung der Klone, die von neuralen Stammzellen stammten, wurde X-gal-Histochemie eingesetzt. Eine große Anzahl an Klonen, die sich aus Embryonalen (A = 50fache Vergr.; B = 200fache Vergr.) oder Adulten (C = 50fache Vergr.; D = 200fache Vergr.) bildeten, wurden nach einer X-gal-Exposition von 8 Stunden blau und zeigen sich in den 2A2F als dunkelgraue oder schwarze Klone. In dem Mark von sowohl embryonalen (E) als auch adulten (F) Mäusen gab es eine Anzahl von Klonen, die sich bei X-gal-Exposition nicht blau färbten, was einen geringen Wert früher endogener hämatopoetischer Zelltypen anzeigt. In den 2E und 2F verfärbten sich die mit Pfeilen markierten kleineren Klone bei X-gal-Exposition nicht blau. Die Maßstabsbalken sind 100 μm (A, C, E & F) sowie 40 μm (B & D).
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liegt in der signifikanten Entdeckung, dass multipotente neurale Stammzellen (MNSCs), die in vitro stark vermehrt werden können, wie in WO 93/01275 und in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschrieben, hämatopoetische Nachkommen erzeugen können.
  • Wenn sich eine MNSC teilt, lässt sie eine Tochter-MNSC entstehen, und ist dadurch zu Selbsterhaltung fähig. Sie kann auch eine Progeniturzelle entstehen lassen, die eine dazu bestimmte undifferenzierte Zelle ist, einen bestimmte differentiativen Weg entstehen lassen. Eine neuronale Progenitorzelle kann sich zum Beispiel beschränkt oft teilen; die sich ergebenden Nachkommen differenzieren sich dann zu Neuronen. Progenitorzellen sind vor der Differenzierung für gewöhnlich zu einer finiten Anzahl von Zellteilungen fähig und sind daher im Gegensatz zu Stammzellen nicht zur Selbsterhaltung fähig. Die undifferenzierten Nachkommen von MNSCs, die hier als „Vorläuferzellen" bezeichnet werden, umfassen Tochter-MNSCs und determinierte Progenitorzellen. Der Betriff „multipotente neurale Stammzelle" („MNSC") bezeichnet eine Zelle, die zu einer weit reichenden Selbsterneuerung fähig ist, d.h. fähig ist, sich während Zellteilung über einen längeren Zeitraum selbst zu ersetzen, und alle wichtigen Zellarten des Gewebes erzeugen kann, in dem sie sich befindet (d.h. Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten). Mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Kulturverfahren können MNSCs induziert werden, sich in vitro in einem festgelegten, Wachstumsfaktor enthaltenden Kulturmedium stark zu vermehren. Die Nachkommen jeder MNSC können sich differenzieren, um Astrozyten, Oligodendrozyten und Neurone zu bilden. Die MNSCs können kontinuierlich in Kultur vermehrt werden, um große Mengen an Nachkommen zu erzeugen, ohne dass die Zellen mit Onkogenen umgewandelt werden müssen oder die Zellen aus tumorigenem Gewebe gewonnen werden müssen. Dies macht die Zellen für therapeutische Anwendungen besonders erwünscht. Die MNSC-Nachkommen können mit Hilfe von Tieftemperaturtechnik oder anderen auf dem Gebiet bekannten Verfahren gelagert werden, bis sie benötigt werden.
  • Der Begriff „hämatopoetische Zelle" bezeichnet eine beliebige Art von Zelle des hämatopoetischen Systems, einschließlich aber nicht ausschließlich undifferenzierte Zellen wie hämatopoetische Stammzellen und Progenitorzellen und differenzierte Zellen wie Megakaryozyten, Erythrozyten, Leukozyten, Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten und natürliche Killerzellen.
  • Bei Setzen in eine geeignete Umgebung, so wie sie hier beschrieben wird, kann eine MNSC induziert werden, sich stark zu vermehren und Nachkommen zu erzeugen, die sich zu Zellen des hämtopoetischen Systems differenzieren. Wenn hier Bezug auf die Umgebung gemacht wird, in die MNSC-Nachkommen gegeben werden, wird an die allgemeine Bedeutung des Begriffs „Umgebung" gedacht. Der Begriff bezeichnet somit die Kombination von externen oder von außen wirkenden physikalischen Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung multipotenter neuraler Stammzellen und/oder deren Nachkommen beeinträchtigen und beeinflussen. Die Umgebung kann ex vivo oder in vivo sein. Undifferenzierte MNSC-Nachkommen regenerieren bei Transplantation in das Kreislaufsystems eines unter Myeloablation leidenden Säugers mit Hilfe der gleichen Transplantationsverfahren, die auf dem Gebiet für Knochenmark- und hämatopoetische Stammzellen-Transplantationen bekannt sind, die ganze Spannweite der verschiedenen Blutzellen und stellen das hämatopoetische System des Säugers wieder her. Dadurch ist ein Kreislaufsystem eines Säugers ein Beispiel einer In-vivo-Umgebung, die MNSCs zur Erzeugung von Zellen des hämatopoetischen Systems induziert.
  • Die Transplantation von undifferenzierten MNSC-Nachkommen hat gegenüber dem Transplantieren von Knochenmark oder gezüchteten hämatopoetischen Stammzellen mehrere Vorteile. Ein Vorteil ist, dass bei Transplantieren von undifferenzierten neuralen Vorläuferzellen das Risiko einer Transplantat-Wirt-Erkrankung wesentlich geringer ist, da keine lymphoiden Zellen transplantiert werden. Ferner ist man der Meinung, dass MNSCs an ihrer Oberfläche weniger oder gar keine Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) aufweisen. Es wurde gezeigt, dass MHC-Moleküle an der Oberfläche von MNSCs von Mäusen fehlen und auch an der Oberfläche von MNSCs anderen Spezien fehlen können (siehe Molluk, A., New Scientist, S. 40 (1998)). Bei der autologen Transplantation besteht ein anderer Vorteil der Verwendung von MNSC-Nachkommen für das Wiederbevölkern des hämatopoetischen Systems eines Patienten darin, dass während oder im Anschluss an Chemotherapie oder Strahlentherapie zur Behandlung von Leukämien und anderen blutbedingten Erkrankungen das Risiko des Wiedereinschleppens von bösartigen oder erkrankten hämatopoetischen Zellen eliminiert wird.
  • Ein anderer Vorteil bei der Verwendung von MNSC-Nachkommen ist, dass festgelegte Kulturbedingungen, die bereits in der Literatur beschrieben wurden, zum Induzieren der Vermehrung von MNSCs verwendet werden können, um problemlos eine große Anzahl an MNSC-Nachkommen aus einer kleinen Ausgangsgewebemenge zu erzeugen.
  • Jedes Gewebe, das MNSCs enthält, kann verwendet werden. Derzeit ist die Verwendung neuralen Gewebes aus jedem MNSCs enthaltenden neuralen Gewebe, einschließlich aber nicht ausschließlich die Großhirnrinde, der Stirnlappen, der Conus medullaris, das Kleinhirn, das Mittelhirn, der Gehirnstamm, das Rückenmark, die Rückenmarksflüssigkeit und das die Ventrikel des zentralen Nervensystems (ZNS) umgebende Gewebe, bevorzugt. Für autologe Transplantationszwecke können diese Gewebe durch Biopsie erhalten werden.
  • Die MNSCs können in vitro kontinuierlich stark vermehrt und passagiert werden, um große Zahlen von Zellen für Transplantationszwecke mit Hilfe bereits auf dem Gebiet bekannter Verfahren zu erzeugen. Zum Vergleich: vorbekannte Verfahren für die In-vitro-Erzeugung von hämatopoetischen Stammzellen erfordern oft komplexe Kulturbedingungen und langwierige Zelltrennschritte und führen zu einer nur beschränkten Vermehrung der Zahlen hämatopoetischer Stammzellen. U.S. Pat. Nr. 5,646,043 und U.S. Pat. Nr. 5,612,211 geben zum Beispiel beide Verfahren für ein beschränktes Maß an In-vitro-Erneuerung von hämatopoetischen Stammzellen an die Hand.
  • Geeignete Verfahren für das Erhalten und Vermehren von MNSCs in Kultur zum Gewinnen angereicherter Populationen von multipotenten neuralen Stammzellen werden in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschrieben, das hiermit durch Erwähnung Bestandteil dieser Erfindung wird. Der Ausdruck „angereicherte Population multipotenter neuraler Stammzellen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Population von Zellen, die einen höheren Prozentsatz an MNSCs enthält, als in dem Gewebe vorhanden sind, aus dem die MNSCs stammen. Typischerweise sind weniger als etwa 0,1% der von einem neuralen Gewebe eines Säugers erhaltenen Zellen MNSCs. Daher enthält eine angereicherte MNSC-Population, die etwa 1% MNSCs enthält, typischerweise mindestens zehnmal mehr MNSC als in dem neuralen Gewebe vorhanden sind, aus dem die MNSCs abstammen. Sekundäre und folgende MNSC-Kulturen, die nach den in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 offenbarten Verfahren erzeugt wurden, liefern im Allgemeinen geeignet angereicherte Populationen von MNSCs. Zur Verwendung bei der Wiederbevölkerung des hämatopoetischen Systems eines Patienten umfasst die angereicherte MNSC-Population vorzugsweise mindestens 1% MNSCs. Bevorzugter sind mindestens etwa 5% der Zellen MNSCs. Noch bevorzugter ist die Verwendung einer angereicherten Population von MNSCs, die mindestens 10% MNSCs umfasst. Es ist möglich, angereicherte MNSC-Populationen zu erhalten, die mindestens 20% MNSCs enthalten. Die Verwendung von hoch angereicherten MNSC-Populationen, die mindestens 15% oder in manchen Fällen 20% MNSCs enthalten, kann wünschenswert sein, da es die Gesamtzell der für die Transplantation erforderlichen Zellen verringern kann.
  • Der Prozentsatz an in einer Kultur vorhandenen MNSCs kann durch Passagieren einer bekannten Anzahl an Zellen von der Kultur zu einem frischen Kulturmedium mit einem oder mehrere Wachstumsfaktoren, der eine starke Vermehrung von multipotenten neuralen Stammzellen induziert, beispielsweise Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), geschätzt werden. Der Prozentsatz an Zellen, die Neurosphären bilden, zeigt den ungefähren Prozentsatz der in der Kultur vorhandenen Stammzellen an. Der Begriff „Neurosphäre" bezeichnet ein Aggregat von Vorläuferzellen, das sich bildet, wenn eine MNSC zu starker In-vitro-Vermehrung induziert wird. Eine Neurosphäre umfasst die Nachkommen einer einzigen MNSC, was die Tochter-MNSCs und undifferenzierte Progenitorzellen einschließt. U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschreibt Neurosphären näher und zeigt Fotographien von Neurosphären. Um die Kultur für MNSCs weiter anzureichern, können Zellsortierverfahren eingesetzt werden, indem determinierte Progenitorzellen von MNSCs getrennt werden.
  • Undifferenzierte MNSC-Nachkommen können in eine „Hämatopoetisch-induzierende Umgebung" gegeben werden, die ihre Differenzierung zu hämatopoetischen Zellen induziert. Der Begriff „hämatopoetisch-induzierende Umgebung" umfasst alle Ex-vivo-Kulturbedingungen oder -behandlungen bzw. jeden Ort in vivo eines Wirts oder Patienten, der MNSCs anregt, hämatopoetische Zellen zu erzeugen. Bei einer Ex-vivo-Kultur können abhängig von dem erwünschten Phänotyp neurale Stammzellen-Nachkommen durch Abwandlung der Kulturumgebung zur Differenzierung entlang einer bestimmten Linie induziert werden, und zwar durch Zugabe von einem oder mehreren Wachstumsfaktoren oder Cytokinen oder Kombinationen davon und/oder gemeinsame Kultur der Zellen mit Zellen ausgewählter Zelllinien oder mit einer Zellschicht, die eine Wachstumsunterlage bietet und/oder von außen wirkende Faktoren in das Kulturmedium freisetzt, die den difterentiativen Weg der MNSC-Nachkommen beeinflussen. Ferner kann eine Manipulation des Substrats, auf dem die Zellen gezüchtet werden, entweder vor der Transplantation oder nach erfolgter Transplantation, das phänotypische Ergebnis einer Population von Zellen beeinflussen. Es können auf dem Gebiet bekannte Kultivierungsverfahren zur Beeinflussung der Differenzierung der MNSC-Nachkommen eingesetzt werden, wie sie zum Beispiel zum Beeinflussen der difterentiativen Determination der Nachkommen früher embryonaler Blastula-Stammzellen bekannt sind (siehe Keller, G. B. (1995) Curr. Opin. Cell Biol. 7: 862–869). Dadurch können Ex-vivo-Verfahren zum Liefern einer Population von MNSC-Nachkommen verwendet werden, die für das Vorhandensein neu erzeugter, undifferenzierter oder gezielt differenzierter Nachkommen der neuralen Stammzellen angereichert ist. Die vorbehandelten Zellen können im undifferenzierten Zustand transplantiert werden oder können alternativ differenziert sein oder sich im Prozess der Differenzierung zu spezifischen Zelltypen befinden, bevor sie transplantiert werden. Es können andere auf dem Gebiet für das Kultivieren von hämatopoetischen Zellen bekannte Kulturbedingungen eingesetzt werden, wie sie zum Beispiel in den U.S. Patenten Nr. 5,612,211 und 5,646,043 beschrieben werden.
  • Beispiele für in vivo hämatopoetisch-induzierende Umgebungen umfassen Kreislaufsystem, Milz, Thymus etc. eines Säugetiers. Undifferenzierte MNSC-Nachkommen zum Beispiel, die mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehen erzeugt wurden, können einem Patienten ohne weitere Ex-vivo-Manipulation systemisch verabreicht werden. Das eigene Kreislaufsystem des Patienten liefert die Umgebung, die MNSC-Nachkommen zur Erzeugung von Zellen des hämatopoetischen Systems induziert. Die neuralen Stammzellen bevölkern in Reaktion auf Umgebungssignale automatisch verloren gegangene oder fehlerhaft funktionierende Zelltypen neu. Die MNSC-Nachkommen können auch dem Kreislaufsystem eines gesunden Säugers verabreicht werden und werden dadurch für den Zweck der Augmentation eines normal funktionierenden hämatopoetischen Systems verwendet. Auf diese Weise dienen die MNSC-Nachkommen als Reservevorrat von Zellen, die bis zu dem Zeitpunkt, da sie benötigt werden, undifferenziert bleiben.
  • Ein weiteres Beispiel einer in vivo hämatopoetisch-induzierenden Umgebung ist das Kreislaufsystem eines Wirtstiers. Eine angereicherte Population von menschlichen MNSCs kann mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Kulturbedingungen erzeugt werden und einem Wirtssäugetier systemisch verabreicht werden, wobei die hämatopoetisch-induzierende Umgebung des Kreislaufsystems des Wirtstiers die MNSCs induziert, Zellen des menschlichen hämatopoetischen Systems zu erzeugen. Die menschlichen MNSCs können vor der Verabreichung in das Wirtssäugetier optional genetisch modifiziert werden, wie nachstehend näher beschrieben wird.
  • Ferner kann das endogene hämatopoetische System des Wirtssäugetiers optional vor der Verabreichung der menschlichen MNSCs beeinträchtigt worden sein, zum Beispiel durch Bestrahlung oder eine andere geeignete Behandlung. Nachdem im Wirtstier eine ausreichende Menge menschlicher hämatopoetischer Zellen erzeugt wurde, werden sie entnommen und in einen menschlichen Patienten transplantiert. Wenn das Wirtstier und der Patient unterschiedliche Spezien sind, wird dieser Prozess als „Xenoinkubation" bezeichnet.
  • Vor der Transplantation können MNSC-Nachkommen auch genetisch modifiziert werden, um die Symptome einer speziellen Erkrankung zu lindern oder um den verschiedenen Nachkommen bei Implantation in Individuen ohne Erkrankung neue Funktionen zu verleihen. Die Zellen könnten zum Beispiel ein erwünschtes Gen enthalten, beispielsweise ein Gen, das ein fehlendes Protein, ein krankheitsresistentes Protein oder ein anderes vorteilhaftes Protein exprimieren könnte. Im Gegensatz zu den anderen Stammzellensystemen, wie ein hämatopoetisches Stammzellensystem, können MNSCs induziert werden, sich unter geeigneten In-vitro-Kulturbedingungen kontinuierlich zu teilen, was sie zu ausgezeichneten Zielen für genetische Modifizierung macht. Der hier verwendete Begriff „genetische Modifizierung" bezeichnet die stabile oder transiente Änderung des Genotyps einer Vorläuferzelle durch absichtliches Einbringen von exogener DNA. Der Begriff schließt auch das Maskieren oder die Deletion eines schädlichen oder unerwünschten Gens ein. DNA kann synthetisch oder natürlich gewonnen sein und kann Gene, Teile von Genen oder andere brauchbare DNA-Sequenzen enthalten. Verfahren für die genetische Modifizierung von Zellen sind auf dem Gebiet wohlbekannt, und Verfahren für die genetische Modifizierung von MNSC-Nachkommen werden in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 offenbart. Es kann erwünscht sein, die MNSC-Nachkommen genetisch zu modifizieren, wenn sie zur Transplantation in einen Patienten zur Linderung der Symptome einer bestimmten Krankheit mit genetischer Grundlage verwendet werden sollen. Die Zellen können vor der Transplantation mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens, wie homologe Rekombination, genetisch modifiziert werden. Mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren können zum Beispiel neurale Stammzellen umgewandelt werden, um die Allele des Chemokin-Rezeptorgens, CCR5, zu exprimieren, die Immunität gegenüber HIV verleiht. Die Zellen werden dann einem AIDS-Patienten (der im allgemeinen ein beeinträchtigtes hämatopoetisches System hat) verabreicht und lassen T-Zellen entstehen, die gegen eine Infektion mit HIV resistent sind (Paxton et al., Nature Medicine 2(4): 412–417 (1996); Liu Rong et al, Cell 86: 367–377 (1996) und Samson et al., Nature 382: 722–725 (1996)).
  • Knochenmarktransplantate werden zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten verwendet, einschließlich aber nicht ausschließlich aplastische Anämie, Immunsystemschwächen, Autoimmunerkrankungen, das hämatopoetische System beeinträchtigende Krebsarten wie Lymphome und Leukämien, Sichelzellenkrankheit, Osteopetrose usw. (siehe O'Reilly, R. J., Blood 62: 941–964 (1983); Thomas, E. D. Blood Cells, 17: 259–267 (1991); und Marmont, A. M. Bone Marrow Transplant 11: 3–10 (1993)). Die Transplantation von MNSC-Nachkommen kann an Stelle von Knochenmark zur Behandlung dieser Krankheiten eingesetzt werden. Ferner kann die intravenöse Verabreichung von MNSC-Nachkommen in Patienten mit Autoimmunerkrankungen die Symptome der Erkrankung lindern (siehe Kenyon, N. S., IBC on Hematopoietic Stem Cells (1997)). MNSC-Nachkommen können auch durch von außen wirkende oder epigenetische Mittel verändert und in normale bzw. nicht erkrankte Individuen implantiert werden, um ihnen ein hämatopoetisches System mit supranormalen Funktionen zu verleihen.
  • Sobald geeignete Mengen an MNSC-Nachkommen, die für einen bestimmten Zweck erforderlich sind, gewonnen sind, werden sie mit Hilfe von Behandlungsformen, die dem Fachmann auf dem Gebiet für die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen bekannt sind, in einen Patienten transplantiert. Für die Behandlung von Menschen gibt es auf dem Gebiet viele Information über Verfahren für die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen (Bensinger et al. J. of Clin. Oncoloy, 13(10): 2547–2555 (1995); und Tricott et al., Blood 85(2): 588–596). Diese Literaturangaben beschreiben klinische Versuche für die Transplantation von autologen peripheren Blutstammzellen für die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems eines Patienten. Diese Studien zeigten, dass eine Infusion von etwa 2 × 106 bis 5,0 × 106 CD34+ Zellen pro Kilogramm Patient zu einer schnelleren Transplantatakzeptanz führt, als wenn weniger CD34+ Zellen verabreicht werden. Weniger als etwa 1% der unfraktionierten Zellen, die aus peripherem Blut gewonnen werden, sind CD34+ (Lu et al., oben). Es wird geschätzt, dass etwa 1–5% dieser CD34+ Zellen hämatopoetische Stammzellen sind. Zum Vergleich: man schätzt, dass etwa 10–20% von sequentiell passagierten Vorläuferzellen, die mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Verfahren vermehrt werden, MNSCs sind. Daher sollte die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems eines Patienten mit Hilfe von MNSC-Nachkommen unter Verwendung von weniger Zellen als bei den bisherigen Verfahren verwendet möglich sein. Dies ist vorteilhaft, da die Verabreichung von weniger Zellen weniger Kryokonservierungsmittel in den Patienten einbringt (unter der Annahme, dass die transplantierten Zellen zuvor gefroren waren). Ein weiterer Vorteil ist, dass dem Patienten weniger Volumen verabreicht wird und dieses gegenüber der länger dauernden Infusion, die für die Verabreichung von peripheren Blutstammzellen erforderlich ist, als Bolusdosis zugeführt werden kann (z.B. Bensinger et al., oben und Tricott et al, oben).
  • Etwa 102 bis 107 und noch typischer etwa 103 bis 106 neurale Vorläuferzellen/kg Körpergewicht sollten für die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems eines menschlichen Patienten, der sich einer myeloablativen Therapie unterzogen hat, reichen. Die optimale Anzahl an Zellen kann mit Hilfe von routinemäßigen klinischen Versuchen ermittelt werden. Die Anzahl benötigter Zellen kann bei einem Patienten, der ein nur teilweise zerstörtes hämatopoetisches System aufweist, anders sein. Klinische Versuche ähnlich denen, wie sie von Tricott et al., oben, und Bensinger et al., oben, beschrieben werden, können zur Ermittlung geeigneter Behandlungsformen für verschiedene Patientenpopulationen verwendet werden.
  • Die Vorläuferzellen werden durch ein geeignetes Verfahren, beispielsweise intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Injektion oder Infusion, in das Kreislaufsystem des Rezipienten eingebracht. Die intravenöse Injektion oder Infusion sind derzeit die bevorzugten Verfahren. Im Allgemeinen wird eine Zusammensetzung hergestellt, die die Vorläuferzellen und eine physiologische Lösung umfasst, beispielsweise Kochsalzlösung, die zur Verwendung als Träger für die Verabreichung der Vorläuferzellen in das Kreislaufsystem geeignet ist. Die Zellen können zuerst in der Lösung gespült werden, um restliches Kulturmedium zu entfernen, oder um bei frisch aufgetauten Zellen restliches Kryokonservierungsmittel zu entfernen. Wenn die MNSC-Nachkommen gefroren waren, ist es bevorzugt, sie aufzutauen, sie in vitro in einem Wachstumsmedium zu kultivieren (d.h. in einem Wachstumsfaktoren enthaltenden Medium, die starke MNSC-Vermehrung induzieren) und sie mindestens einmal vor der Transplantation zu passagieren. Dies gewährleistet die Lebensfähigkeit der Zellen und entfernt überschüssiges Kryokonservierungsmittel. Die Endkonzentration der Vorläuferzellen ist nicht entscheidend, solange eine ausreichende Anzahl an Vorläuferzellen verabreicht wird. Für eine einfachere Verabreichung und zum Komfort des Patienten ist es für gewöhnlich bevorzugt, das Gesamtvolumen der verabreichten Zellsuspension zu minimieren, solange die Zellen dem Patienten ohne Verklumpen mühelos injiziert oder infundiert werden können.
  • Die Endkonzentration liegt im Allgemeinen in dem Bereich von etwa 107 bis 109 Vorläuferzellen/ml. Die Zusammensetzung aus physiologischer Lösung/Vorläuferzellen kann weiterhin hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) oder Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktor (G-CSF) umfassen, um den Zeitraum zu beschleunigen, in dem bestimmte Zelltypen erzeugt werden. Alternativ können dem Patienten Wachstumsfaktoren vor oder nach der Verabreichung der Vorläuferzellen verabreicht werden. Vor der Transplantation wird eine Dosisform hergestellt, die eine die Zusammensetzung aus Vorläuferzellen/physiologischer Lösung enthaltende Vorrichtung umfasst. Die Vorrichtung kann jede Vorrichtung sein, die für die Zufuhr der Vorläuferzellen zu einem Patienten geeignet ist. Solche Vorrichtungen können Spritzen, Infusionsbeutel oder ähnliche Behälter für die intravenöse Verabreichung der Vorläuferzellenzusammensetzung an den Patienten umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt.
  • Wie nachstehend in Beispiel 4 unter Verwendung eines Mausmodells genauer erläutert wird, führt die Transplantation von MNSC-Nachkommen in Rezipienten, die einer Ganzkörperbestrahlung unterzogen wurden, um die funktionsfähigen hämatopoetischen Stammzellen zu dezimieren, zur Rekonstitution des hämtopoetischen Systems. Man meint, dass der Vorgang in den meisten Fällen zu einer permanenten Wiederherstellung des hämatopoetischen Systems führt. Bei einigen Erkrankungen können aber wiederholte Transplantationen erforderlich sein.
  • Es geht aus der Beschreibung dieser Anmeldung und den nachstehenden Beispielen hervor, dass die MNSC-Nachkommen eine ideale Alternative zur derzeitigen Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems oder deren Zugeben zum hämatopoetischen System eines Tiers oder Menschen darstellen.
  • Alle zitierten Quellennachweise, Patente und Patentanmeldungen werden durch Erwähnung in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung. Die folgenden Beispiele und Zeichnungen dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen in keiner Weise als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung ausgelegt werden.
  • BEISPIEL 1: Erhalten von MNSCs aus Neuralgewebe
  • A. Embryonales Gewebe
  • Striatales Gewebe aus den Gehirnen von 14 Tage alten CD1- und TGR-ROSA-Mäuseembryos (Charles River) wurde mit Hilfe eines sterilen Eingriffs entnommen. Das Gewebe wurde mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette in serumfreies Medium bestehend aus einem 1:1-Gemisch von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und F-12-Nährstoff (Gibco) mechanisch aufgespalten. Die aufgespaltenen Zellen wurden bei 800 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand angesaugt und die Zellen in DMEM/F-12-Medium zum Zählen resuspendiert.
  • B. Adultes Gewebe
  • Striales Gewebe aus den Gehirnen von adulten TGR-ROSA-Mäusen (diese Tiere sind mit β-Gal genetisch markiert, was die Detektion in Wirtstieren erlaubt), RAG-1-Mäusen (Stamm von Mäusen mit Nullmutation, die keine reifen, funktionsfähigen B- und T-Blutzellen erzeugen können, negative Kontrollsphären) und C57BL/6J-Mäusen (Hintergrundzuchtmaterial für RAG-1-Mäuse mit Nullmutation). Die Stammzellen von TGR-ROSA- und C57BL/6J-Tieren, aber nicht von RAG-1-Mäusen, sollten die B- und T-Blutzellenkompartimente von Wirtstieren rekonstituieren können. Diese Gewebe wurden entfernt und in 500 μl große Abschnitte zerlegt und sofort in calciumarme, mit Sauerstoff angereicherte künstliche Rückmarkflüssigkeit (Ca2+-armer aCSF) übertragen, die 1,33 mg/ml Trypsin, 0,67 mg/ml Hyaluronidase und 0,2 mg/ml Kynurensäure enthielt. Das Gewebe wurde in dieser Lösung 90 Minuten lang bei 32°C–35°C gerührt. aCSF wurde abgegossen und durch frisches, mit Sauerstoff angereichertes aCSF 5 Minuten lang ersetzt. Das Gewebe wurde in eine DMEM/F-12/10%-Hormonlösung, die 0,7 mg/ml Ovomucoid enthielt, übertragen und mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette vermahlen. Die Zellen wurden bei 400 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand angesaugt und die granulierten Zellen wurden in dem DMEM/F-12/10%-Hormongemisch resuspendiert.
  • BEISPIEL 2: Herstellung angereicherter MNSC-Populationen
  • Aus Beispiel 1 erhaltene adulte Zellen wurden in nicht beschichteten 35-mm-Petrischalen (Costar), die Complete Medium, 10 ng/ml bFGF und 20 ng/ml EGF [gereinigt aus Mäuseunterkieferdrüse (Collaborative Research) oder menschlicher Rekombinante (Gibco/BRL)] enthielten, plattiert. Embryonale Zellen, die mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen gleichen Verfahren gewonnen wurden, wurden in dem gleichen Kulturmedium gezüchtet, mit der Ausnahme, dass kein bFGF zugegeben wurde. Complete Medium ist ein serumfreies Medium bestehend aus DMEM/F-12 (1:1), das Glucose (0,6%), Glutamin (2 μM), Natriumbicarbonat (3 mM) und HEPES (4-[2hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure)-Puffer (5 mM) (alle von Sigman, mit Ausnahme des Glutamin [Gibco]) enthält. Complete Medium wird ein festgelegtes Hormongemisch und Salzgemisch (Sigma) zugesetzt, das Insulin (25 μg/ml), Transferrin (100 μm/ml), Progesteron (20 nM), Tetramethylendiamin (60 μM) und Selenchlorid (30 nM) umfasst. Die in den Kulturen vorhandenen murinen MNSCs vermehrten sich stark, was Neurosphären entstehen ließ.
  • Nach 6–7 Tagen in vitro ließ man die Neurosphären in der unteren Ecke des Kolbens absetzen. Die Neurosphären wurden dann in 50 ml große Zentrifugengläser übertragen und bei 300 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Neurosphären wurden in 1 ml des Proliferationsmediums resuspendiert, in dem sie gezüchtet worden waren. Die Neurosphären wurden mit einer feuerverengten Pasteuer-Pipette aufgespalten und pulverisiert, um eine einzellige Suspension zu bilden. Die Zellen wurden gezählt und bei 50.000 Zellen/ml in Complete Medium erneut ausplattiert. Neue Neurosphären bildeten sich nach ein paar Tagen. Dieser Proliferations-/Passagierprozess wurde viermal ausgeführt.
  • BEISPIEL 3: Herstellung von klonal abgeleiteten MNSC-Nachkommen
  • Die Zellen von Neurosphären, die aus adultem strialen ROSA-Gewebe mit Hilfe der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wurden auf etwa 1 Zelle pro Vertiefung in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen (200 μl Wachstumsmedium/Vertiefung) verdünnt, um klonal abgeleitete MNSC-Nachkommen zu erzeugen. Das Vorhandensein einer einzigen Zelle in einer Vertiefung wurde mit Phasenkontrastmikroskopie bestätigt. Einzelne Neurosphären entwickelten sich in etwa 20% der Vertiefungen, was anzeigt, dass jede dieser Vertiefungen eine einzelne MNSC enthielt, die sich stark vermehrte, um die Neurosphäre zu bilden. Die Neurosphären wurden wie in Beispiel 2 beschrieben passagiert. Nach mehreren Passagen wurden die Neurosphären etwa vier Tage nach Bildung zur Transplantation gesammelt.
  • BEISPIEL 4: Regeneration des hämatopoetischen Systems unter Verwendung von MNSCs
  • Es wurden gleichen Anzahlen an 2,5 bis 3 Monate alten männlichen und weiblichen adulten Balb/c-Mäusen (25 b 30 g, Charles River) einer Ganzkörperbestrahlung (850 Rad) unterzogen, um funktionsfähige hämatopoetische Stammzellen stark zu dezimieren. Die Bestrahlungsabläufe folgten im Wesentlichen den von Tarbel et al., Development 121: 4077–4083 (1987) und Down et al., Blood 3: 661–669 (1991) beschriebenen Abläufen. Aufgrund der Häufigkeit von Magendarm- und Lungentoxizität, über die in der Literatur im Anschluss auf Einzeldosen von 850 Rad berichtet wird, wurde eine fraktionierte Dosis von 450 Rad, gefolgt von 400 Rad 4 Stunden später, verwendet, was dazu führte, dass die kumulative vom Weichgewebe absorbierte Dosis bei etwa 850 Rad lag. Während der Bestrahlung wurden die Tiere per Videokameras ständig auf Bewegung überwacht. Es wurden mehrere Maßnahmen getroffen, um sicherzustellen, dass alle Körperregionen gleiche Strahlungsmengen erhielten: 1) die Mäuse wurden in einen Lucite-Käfig mit Abmessungen gegeben, die verhinderten, dass die Tiere übereinander kletterten (was die erhaltene Dosis verändern könnte), 2) jeder Teil der Gesamtdosis wurde mit der Kobaltquelle zuerst an einer dorsalen, dann einer ventralen Position verabreicht und 3) es wurden Kalibrierungsdetektionsvorrichtungen an der Oberseite, am Boden und an den Wänden des Behälters sowie an dem dorsalen Aspekt eines Tiers und dem ventralen Aspekt eines zweiten Tiers jeder Gruppe aufgeklebt, um die von jeder Tiergruppe aufgenommene präzise Dosis genau zu messen. In jedem Fall ermittelten die eingesetzten Kalibrierungsvorrichtungen, dass die von den verschiedenen Tiergruppen aufgenommene tatsächliche Dosis bei 850 Rad ±2% lag.
  • Mehrere Chargen angereicherter MNSC-Populationen, die wie in Beispiel 2 und 3 hergestellt wurden, wurden bei Raumtemperatur in EBSS (Earle's Mineralsalzmedium) resuspendiert. Die Zellen wurden dann bis kurz vor der Transplantation bei 4°C gehalten, woraufhin sie auf Körpertemperatur erwärmt wurden, um einen Temperaturschock des Rezipiententiers zu vermeiden.
  • Einem Teil der bestrahlten Mäuse („Rezipientenmäuse") wurde 16 Stunden nach Beendigung des zweiten Bestrahlungsvorgangs eine angereicherte Population von MNSCs injiziert, die wie vorstehend in Beispiel 2 oder 3 hergestellt wurden. Die für die Überwachung und die Prüfung der bestrahlten Mäuse zuständigen Untersucher erhielten keine Angaben zum Inhalt jeder Zellphiole und auch nicht zu den Rezipienten- und Kontrolltieren. Den Rezipientenmäusen wurde (mittels Schwanzveneninjektion) 0,2 ml einer angereicherten MNSC-Population in warmem EBSS (Körpertemperatur) verabreicht. Die Kontrollmäuse erhielten nur warmes EBSS bzw. murine Fibroblasten (etwa 106 3T3-Zellen). Als positive Kontrolle erhielten einige der Rezipientenmäuse eine Injektion frisch gewonnener ROSA-Knochenmarkzellen (etwa 27.000.000 Zellen).
  • Vor der Transplantation wurden einige der MNSC-Chargen Cytokinen ausgesetzt. Die Cytokin-Behandlung bestand aus: Stammzellfaktor (10 ng/ml), Interleukin (IL) – lalpha (2 ng/ml), IL-2 (10 ng/ml), IL-3 (5 ng/ml) und IL-6 (10 ng/ml). Diese Vorbehandlung wurde den Zellen 24 Stunden, bevor die Zellen in das Rezipiententier injiziert wurden, verabreicht.
  • Da Anfälligkeit gegenüber infektiösen Agenzien ein Problem im Anschluss an eine Belastung durch letale Ganzkörperbestrahlung ist, wurden mehrere Maßnahmen ergriffen, um dies anzugehen. Die Tiere erhielten erstmals 48 Stunden vor der Bestrahlung Antibiotika (Neomycinsulfat, 1 mg/ml, dem Wasser zugesetzt) und ihr Trinkwasser wurde angesäuert (pH 3,5 bis 4,0), um die bakterielle Flora im Darm zu reduzieren. Die Mäuse wurden in Filterkäfigen in Räumen untergebracht, die zur sicheren Unterbringung von immunschwachen Tieren ausgelegt waren, und wurden mit sterilisierter Nahrung und sterilisiertem Wasser versorgt. Schließlich trug das Laborpersonal bei der Arbeit mit den Tieren Mäntel, Handschuhe, Kopfbekleidung und Masken.
  • Die bestrahlten Tiere wurden täglich beobachtet, wobei Körpergewicht, Fellzustand, Aussehen der Augen, Beweglichkeit und allgemeine Körperhaltung überwacht und jeden zweiten Tag aufgezeichnet wurden, um den physiologischen Zustand zu verfolgen. Tiere, die Appetitverlust, verminderte Beweglichkeit, Durchfall und starken Gewichtsverlust aufwiesen, wurden durch zervikale Dislokation euthanisiert, und ihr Blut und ihre Organe wurden durch die nachstehend beschriebene immunhistochemische und fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) auf hämatopoetische Zelltypen und Transplantationsakzeptanz (wo zutreffend) untersucht. Alle Tiere, die vorzeitig verstarben, wurden obduziert, um die Todesursache zu ermitteln.
  • Ergebnisse:
  • Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Anzahl an Tieren, die jede Behandlung überlebten.
  • TABELLE I
    Figure 00210001
  • Die Mehrzahl der MNSC-Nachkommen und Knochenmark-Rezipiententiere überlebten die Behandlung (mehr als 6 Monate), während die Mehrzahl der Negativkontrolltiere (die nach der Bestrahlung Fibroblasten, Kochsalzlösung oder keine Injektion erhielten) nicht länger als 30 Tage überlebten. An Negativkontrolltieren durchgeführte Autopsien deckten für gewöhnlich kleine und gelegentlich fehlende Milzen und/oder Thymusdrüsen auf, was auf ein stark beeinträchtigtes hämatopoetisches System hinweist. Im Einklang mit diesem Zustand stand das Vorhandensein kleiner, graufarbener Lebern bei den Kontrollmäusen mit den längsten Überlebenszeiten, was einen signifikanten Verlust an roten Blutkörperchen nahe legt. Im starken Kontrast dazu schienen die überlebenden MNSC-Rezipientenmäuse über einen längeren Beobachtungszeitraum (bis zu 15 Monate) gesund und aktiv zu sein.
  • Zum Testen auf Transplantationsakzeptanz von Spenderzellen wurde peripheres Blut der Überlebenden 7 bis 11 Monate nach der Transplantation gesammelt und einer Durchflusszytometrie-FACS-Analyse unterzogen, und es wurde eine PCR-Amplifikation des Lac Z Gens festgestellt. β-Galaktosidase wurde in einer Reihe von hämatopoetischen Zelltypen festgestellt, was nahe legt, dass die vollständige Rekonstitution aller wesentlichen hämatolymphatischen Linien eingetreten war.
  • Durchflusszytometrie-Analyse
  • 7 bis 11 Monate nach Beendigung des Schwanzvenen-Injektionsvorgangs (wobei die Studie noch unter Verwendung eines „Doppelblind"-Formats lief), wurde von den repräsentativen Mäusen jedes Zustands peripheres Blut geerntet und auf das Vorhandensein von β-Gal-Aktivität und hämatopoetischer Oberflächenantigenexpression hin untersucht (Berger et al. J. Cytometry, 17: 216–223 (1994). Zur Erleichterung der Detektion von β-gal+ hämatopoetischen Zelltypen wurde der FluoroReporter lac-Z-Durchflusszytometrie-Kit (Molecular Probes Nr. F-1931) eingesetzt. Im Grunde wurden lebensfähige hämatopoetische Zellen mittels hypotonischen Schocks mit einer fluorogenen Beta-Galaktosidasesubstrat-Fluorescein-di-beta-D-Galactopyranosidase (FDG) beladen. Nicht fluoreszente FDG wird durch β-Galactosidase sequentiell hydrolisiert, um ein hoch fluoreszentes Fluorescein zu erzeugen, das durch die Durchflusszytometrieanalyse mühelos festgestellt werden kann. Aufgrund der hypotonischen Beladung von FDG bleiben die Zellenoberflächenantigene intakt und der Propidiumiodidauschluss zum Testen auf Lebensfähigkeit kann immer noch verwendet werden. Dieses Vorgehen zeigte das Vorhandensein von β-gal-positiven Zellen im peripheren Blut von Rezipientenmäusen an. Das so genannte Backgating der β-gal-positiven Zellen in Mäusen, die mit ROSA-Knochenmark oder MNSC-Nachkommen wiederbevölkert wurden, zeigte ein ähnliches Verteilungsmuster, was nahe legt, dass in beiden Tieren ähnliche Zelltypen erzeugt wurden.
  • Neben dem lacZ-Gen exprimieren ROSA-96-Zellen ein MHC-Typ-1-Molekül (in der Maus als H-2-Typ bezeichnet), das sich von den Balb/c-Wirten unterscheidet (H-2Kb bzw. H-2Kd). Daher war es möglich, das Vorhandensein und den sich ergebenden Phänotyp von MNSC-Nachkommen in transplantierten Tieren mit Hilfe von Immunocytochemie zu überwachen. Um eine Transplantationsakzeptanz zu detektieren, wurden verschiedene hämatopoetische Gewebe (einschließlich Blut) von transplantierten Tieren und von Kontrolltieren für Durchflusszytometrie mit Hilfe von H-2Kd- und N-2Kb-Antikörpern bearbeitet, um verschiedene H-2-Isotypen zu detektieren. Die verwendeten Antikörper waren CD4 (Nr. 09005A), CD11b (01715B), CD19 (O9655B) und H-2Kb (06105A), alle als Phycoerythrin(PE)-Konjugate, biotinylierte H-2Kb (06102D) und H-2Kd (06092D) sowie Mäuse-IgG1a, K (Isotypkontrolle), alle von Pharmingen (San Diego, CA). Alle primären Antikörper wurden bei 1:50 verwendet.
  • Streptavidin-FITC-Konjugat (Jackson Laboratories; Mississauga, ON) wurde bei einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Alle zu Erzeugen von Daten verwendeten Tiere hatten mindestens 6 Monate lang nach Bestrahlung überlebt.
  • Es wurden Zellsuspensionen aus Milz und Thymus in EBSS durch Schneiden des Organs in kleine Stücke, dann Mahlen zwischen zwei mattierten Corning-Objektträgern erzeugt. Knochenmark wurde aus den Oberschenkelknochen mit EBSS gespült. Erythrozyten wurden in 144 mM NH4Cl, 17 mM Tris-Cl, pH 7,2 vier Minuten lang bei Raumtemperatur lysiert. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer (EBSS+ 1,0% fötales Kalbsserum) gespült, bei 1.100 U/min. 7 Minuten lang zentrifugiert und vor dem Zählen in FACS-Puffer resuspendiert. Für das Antikörperfärben wurden 50 μl Antikörperlösung mit 50 μl Zellsuspension (1,0 × 106 Zellen) gemischt und 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden in FACS-Puffer gespült, bei 1.100 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert, in 50 μl FAS-Puffer resuspendiert und mit 50 μl eines sekundären Antikörpers (falls zutreffend) 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Schließlich wurden die Zellen in FACS-Puffer gespült, zentrifugiert und zur Durchflusszytometrieanalyse in 500 μl EBSS resuspendiert. Es wurden Isotypkontrollen verwendet, um „Gates" zu setzen, wenn biotinylierte Antikörper eingesetzt wurden. Bei den direkt markierten Antikörpern wurden Gates nur mit Zellen gesetzt. Unmittelbar vor der Durchflusszytometrieanalyse wurde den Kontrollsuspensionen Propidiumiodid zugegeben, um eine Lebensfähigkeit von > 95% sicherzustellen. Die Durchflusszytometrieanalyse wurde auf einem FACScan (Becton-Dickinson) durchgeführt, wobei alle Vorgänge an der Vorwärts /Seitenstreuung gegated wurden, um die Anzahl an H-2Kb+ Zellen zur Gesamtzahl an Gate-Vorfällen (n = 6, ± S. E. M.; p < 0,05) zu quantifizieren. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle II gezeigt.
  • TABELLE II
    Figure 00240001
  • Es wurden Dot-Blots von H-2Kb- kontra H2kd-positiven Zellen in peripherem Blut und H-2Kb-markierten CD4-(T-Zellen), CD19-(B-Zellen) oder CD11b-(Granulozyten) positiven hämatopoetischen Zelltypen in Milzzellensuspensionen von nicht bestrahlen Kontrolltieren (ROSA26, Balb/c) und bestrahlten Rezipiententieren erzeugt. Die H-2Kb-positiven Zellen wurden in der Milz und in dem peripheren Blut von Tieren festgestellt, die entweder ROSA-Knochenmark oder MNSC-Nachkommen erhalten hatten. Keine H-2Kb-positiven Zellen wurden in Tieren gefunden, denen nur EBSS injiziert worden war. Bei Rezipienten von neuralen und hämatopoetischen Stammzellen wurden H-2Kb-positive Zellen auch in anderen hämatopoetischen Geweben gefunden, einschließlich Knochenmark und Thymus. Die Populationen jedes der differenzierten Phänotypen (die alle der terminal differenzierten hämatopoetischen Zelltypen mit Ausnahme von Erythrozyten darstellen) erwiesen sich in der Milz von hämatopoetischen und MNSC-Rezipienten als doppelmarkiert mit dem H-2Kb-Antigen.
  • Eine weitere immunocytochemische Analyse von H2Kb-positiven Zellen in MNSC-Nachkommenrezipienten zeigte das Vorhandensein von T-Linienzellen (H-2Kb+/CD81; H-2Kb+/Cd3e+), B-Linienzellen (H-2Kb+/B220+; H-2Kb+/IgM+; H-2Kb/IgD), Granulozytenlinienzellen (H-2Kb+/CD89+) und Myeloidlinienzellen (H-2Kb+/Mac-3+) auf, was belegte, dass MNSC-Nachkommen alle wichtigen hämatopoetischen Zelllinien erzeugten.
  • Tabelle III zeigt den Prozentsatz der ROSA26-Zellen (H-2Kb+) in den Milzen von transplantierten Tieren und Kontrolltieren, die auf die hämatopoetischen spezifischen Antigene CD3e (T-Zellen), CD11b (Granulozyten) und CD 19 (B-Zellen) doppelmarkiert waren, und zwar 7 bis 11 Monate nach Transplantation durch Durchflusszytometrie getestet. Eine signifikante Anzahl an doppelmarkierten Zellen fand sich in Tieren, denen ROSA26-Knochenmark, embryonale neurale Stammzellen (NSCs) und klonal abgeleitete adulte NSCs injiziert worden waren. Alle Prozentsätze werden zur Gesamtzahl der Gate-Vorfälle berechnet (n = 6, ± S. E. M.; p < 0,05).
  • TABELLE III
    Figure 00250001
  • Um die durchflusszytometrischen Ergebnisse weiter zu bestätigen, wurden die gleichen Proben mit einer Cytospin auf Deckgläser zentrifugiert und mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Um dies zu verwirklichen, wurden Zellen, die zuerst für die durchflusszytometrische Analyse (siehe oben) erzeugt wurden, mit Hilfe von 4% Paraformaldehyd/0,1% Gluteraldehyd in einem Verhältnis von 1:1 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Dann wurden die Zellen auf Deckgläser, die mit 10% Rattenalbumin (Gibco BRL) vorbeschichtet worden waren, mit einer Cytospin bei 700 U/min. 8 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Deckgläser wurden mit Hilfe von Fluorosave (Calbiochem, La Jolla, CA) montiert und unter Verwendung eines Zeiss Axioscop Fluoreszenzmikroskops visualisiert.
  • Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Alle differenzierten hämatopoetischen Linien wurden in bestrahlen Tieren beobachtet, die EBSS erhielten, doch keine der Zellen exprimierte das H-2Kb-Antigen. Bei Tieren, die aus ROSA-26 gewonnenes Knochenmark erhielten, wurden alle differenzierten Phänotypen beobachtet, wobei ein erheblicher Anteil dieser Zellen H-2Kb exprimierte. Ein ähnliches Ergebnis wurde in Tieren beobachtet, die MNSC-Nachkommen erhielten, was belegt, dass eine MNSC-Transplantation eine Knochenmarktransplantation ersetzen kann. Mit H-2Kb und entweder CD4, CDIIb oder CD19 doppelmarkierte Zellen wurden in Tieren visualisiert, die MNSC-Nachkommen erhielten, die gemäß den Beispielen 2 und 3 erzeugt worden waren.
  • Zur qualitativen Identifizierung der Transplantationsakzeptanz von neuralen Stammzellen in früheren hämatopoetischen Linien wurde das Knochenmark von MNSC- und Knochenmark-transplantierten Tieren zur Verwendung in klonogenen In-vitro-Assays isoliert. Die aus dem Knochenmark isolierten Zellen wurden auf eine Dichte von 500 Zellen/mL in IMDM verdünnt, supplementiert mit 2% HIFBS (Gibco BRL). Die Zellen wurden laut Herstelleranweisungen MethoCult (Stem Cell Technologies Inc) zugegeben, wurden mit den entsprechenden Cytokinen supplementiert, in einem 1/10 v/v Verhältnis, und es wurden 1,1 mL in 35 mm Schalen gegeben und 10–14 Tage bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre belassen. Die benutzten Cytokine waren: Interleukin-3 (10 ng/mL), Interleukin-7 (10 ng/mL), Stammzellenfaktor (50 ng/mL), Erythropoietin (3 U/mL) (R & D Systems) und Interleukin-6 (10 ng/mL; Novartis). X-Gal-Histochemie wurde verwendet, um β-Galactosidase-Aktivität in Klonen neuralen Stammzellenursprungs zu detektieren. 10–14 Tage nach dem Plattieren wurde Methylcellulose-Kulturen eine X-Gal-Arbeitslösung bestehend aus 5 mM K3F3(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)63H1O, 2 mM MgCl2 (Sigma) und X-gal (in Dimethylsulfoxid; Molecular Probes) zu einer Endkonzentration von 1 mg/mL in PBS (pH 7,4) zugegeben. Die Kulturen wurden 8 Stunden lang bei 37°C 400 μl X-Gal-Arbeitslösung ausgesetzt. Mit Hilfe eines Kodak Ektachrom-400-Diafilms unter Verwendung einer Canon Epoh Kamera, die auf einem inversem Zeiss Axiophot Mikroskop montiert wurde, wurden Fotos gemacht. Unter Kontrollbedingungen verfärbte sich keine der aus Balb/c-Knochenmark gewonnenen Kolonien blau, während die Mehrzahl der ROSA26-Klone dies tat. Aus Tieren, die entweder embryonale oder adulte Stammzellen erhalten hatten, isoliertes Knochenmark ließ Kolonien von Zellen entstehen, die sich bei Exposition mit X-gal blau verfärbten (2A2D), was nahe legt, dass neurale Stammzellen sowohl frühe als auch späte hämatopoetische Zellen entstehen lassen können. Es gab eine Reihe von Klonen, die aus Tieren isoliert wurden, die entweder adulte oder embryonale neurale Stammzellen erhalten hatte, und die sich bei Exposition mit X-gal nicht blau verfärbten (2E & 2F). Dies ist wahrscheinlich auf das Vorhandensein endogener Knochenmarkzellen zurückzuführen, die nicht in Folge der Bestrahlung eliminiert worden waren. Die Identitäten dieser Klone schienen ein breites Spektrum früher Zellen zu umfassen.
  • Eine in Verbindung mit Immunocytochemie durchgeführte FDG-β-Gal-Detektion zeigte das Vorhandensein von T-Linienzellen (β-gal+ CD4+; β-gal+ CD8a+; β-gal+ CD3e+), B-Linienzellen (β-gal+ B220+; β-gal+ IgM+; β-gal+ IgD+), Granulozytenlinienzellen (β-gal+ CD89+) und Myeloidlinienzellen (β-gal+ Mac-1+), was beweist, dass MNSC alle wichtigen hämatopoetischen Linien erzeugten.
  • Zur Identifizierung möglicher Transplantationsakzeptanz durch neurale Stammzellen, wurde das Vorhandensein oder Fehlen von lacZ in DNA, die aus den Milzen von 7 bis 12 Monate vorher transplantierten Tieren isoliert wurde, mit Hilfe von PCR geprüft. Das vorbeschriebene sogenannte Primer-Dropping-Verfahren (H. Wong, W. D. Anderson, T. Cheng K. T. Riabowol, Anal Biochem. 223, 251 (1994)) wurde zum Amplifizieren genomischer DNA mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion benutzt.
  • Kurz gesagt wurden 10 μg genomischer DNA über Nacht mit Hilfe von EcoRi verdaut, und es wurden 0,5 μg als PCR-Schablone verwendet. Es wurden 40 Zyklen zu 94°C (1 Minute), 60°C (1 Minute) und 72°C (1 Minute) verwendet, um lacZ mit Hilfe des folgenden Primer-Paars zu amplifizieren: 5'-TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA und 3'-TCA ACC ACC GCA CGTA TAG AGA TTC. Nach 20 Zyklen wurden als interne Kontrolle für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase spezifische Primer (GAPDH, 5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT und 3'AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC) zugegeben.
  • In den Tieren, die Träger-EBSS erhielten, wurde kein LacZ festgestellt: Zum Vergleich: Tiere, die ROSA26-Knochenmark erhielten, erzeugten ein sehr starkes Signal. LacZ wurde auch in Tieren festgestellt, denen ROSA-MNSC-Nachkommen transplantiert wurden. Dies schien unabhängig von der Zellenquelle zu sein, da Tiere, denen entweder embryonale oder adulte (einschließlich klonal abgeleitete adulte) neurale Stammzellennachkommen injiziert wurden, ein starkes Signal erzeugten. Zum Ausschluss der Möglichkeit eines falschen negativen Ergebnisses wurde das gencodierende GAPDH mit lacZ im gleichen Reaktionsglas gemeinsam amplifiziert. Das Vorhandensein eines schwach amplifizierten GAPDH-Signals unter allen Bedingungen zeigte an, dass die lacZ-Amplifzierung echt war.
  • Eine weitere Analyse umfasste die Southern-Blot-Analyse, die Umkehrtranskription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und genomische PCR der geernteten Gewebe, um β-gal+ Zellen in dem peripheren Blut zu identifizieren.
  • BEISPIEL 5: Fähigkeit von MNSCs, das hämatopoetische System zu erhalten
  • Die Fähigkeit der MNSCs, neue hämatopoetische Stammzellen zu erzeugen, wird durch Entnahme von Knochenmark aus den überlebenden, bestrahlten Tieren von Beispiel 4, die markierte Zellen neuralen Ursprungs erhalten hatten, und Injizieren der erzeugten Knochenmarkzellen in bestrahlte Rezipiententiere, bei denen die endogenen hämatopoetischen Stammzellen stark dezimiert oder zerstört wurden, ermittelt. Die Genesung der bestrahlten Tiere und das Vorhandensein markierter Zellen im Knochenmark der Rezipienten zeigen an, dass das Knochenmarktransplantat lebensfähige hämatopoetische Stammzellen enthielt, die ursprünglich aus neuralem Gewebe abgeleitet wurden.
  • BEISPIEL 6: Behandlung von Immunschwäche
  • Mäuse, die eine Keimlinienmutation in einem Rekombination aktivierenden Gen (RAG-1) tragen, weisen eine völlige Unfähigkeit auf, reife B- oder T-Lymphozyten zu erzeugen (Mombaerts et al., Cell 68: 869–877 (1992). Das Immunsystem dieser mutierten Mäuse kann als das von nicht durchlässigen SCID-Mäusen (schwere kombinierte Immunschwäche) beschrieben werden. RAG-1-Zuchtmaterial (Stamm C57BL/6J-Rag1bn1Mom) ist von Jackson Laboratories (Nr. JR2216) erhältlich.
  • MNSC-Nachkommen wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben mit Hilfe von neuralem Gewebe, das von RAG-1-Mäusen und von Hintergrundstamm-C57BL/6J-Mäusen (Jackson Nr. 664), die nicht die RAG-1-Mutation haben, erhalten wurde, erzeugt. Mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden etwa 1.000.000 C57BL/6J-Vorläuferzellen intravenös in die vorgewärmte Schwanzvene der RAG-1-Jungen vor dem Erreichen eines Alters von 3 Wochen injiziert. Ab 4–6 Wochen nach Injektion wurde von den Rezipiententieren Blut geerntet und auf die Detektion von Serum CD3e (T-Zellenrezeptor) geprüft; Mombaerts et al., oben. Das Vorhandensein von CD3e zeigt das Vorhandensein reifer T-Lymphozyten an, welche Zellen sind, die sich normalerweise nicht in RAG-1-Mäusen finden. Ferner kann auch das Vorhandensein von IgM und IgD, die das Vorhandensein reifer B-Lymphozyten anzeigen, die ebenfalls normalerweise nicht in RAG-1-Mäusen gefundene Zellen sind, geprüft werden; Mombaerts et al., oben. Eine Subpopulation der Tiere, die auf diese reifen Zelltypen positiv testen, wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion getötet und auf Nachweis von Hämatopoese geprüft.
  • Ergebnisse:
  • Bei Testen mit Hilfe der FACS-Analyse zeigte das Blut von experimentellen RAG-1-Tieren, die C57BL/6J-MNSC erhalten hatten, positive Ergebnisse bezüglich CD3e, einem Marker für den T-Zellenrezeptor, der sich auf funktionsfähigen T-Zellen findet. Das Blut der Mäuse dagegen, die entweder RAG-1 oder EBSS erhalten hatten, wies negative Ergebnisse bezüglich des CD3e-Markers auf. Dies demonstriert, dass die MNSC-Transplantation zur Behandlung genetischer Defekte des hämatopoetischen Systems verwendet werden kann.
  • BEISPIEL 7: Allogene Transplantation zur Behandlung genetischer Defekte
  • Es wurden gesunde MNSC-Nachkommen aus normalem neuralen Gewebe erzeugt, das aus einer Biopsie eines menschlichen Spenders erhalten wurde, und wurden in vitro mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren stark vermehrt, um eine angereicherte Bevölkerung menschlicher multipotenter neuraler Stammzellen zu erhalten. Die MNSC-Nachkommen werden in einen einwilligenden Patienten mit einer genetischen Erkrankung des hämatopoetischen Systems, beispielsweise – aber nicht einschränkend – Sichelzellenanämie, transplantiert. Dem Patienten werden die MNSC nach Erhalt einer Chemotherapie oder Strahlentherapie zur Dezimierung der hämatopoetischen Stammzellenpopulation des Patienten verabreicht. Die Zellen werden intravenös über einen Zeitraum von 24–48 Stunden bei einer Dosis von 1 × 102 bis 5 × 106 Zellen/kg verabreicht. Der optimale zeitliche Verlauf der Verabreichung und die Anzahl der zu verabreichenden Zellen müssen eventuell in einigen Fällen über dieser Zahlenangabe liegend modifiziert werden. Die MNSCs werden 36–48 Stunden nach der letzten Dosis Chemotherapie oder Strahlentherapie verabreicht. Ausgewählte Wachstumsfaktoren und/oder Cytokine, die bekanntlich Hämatopoese fördern (GF-CSF oder G-CSF bei einer Dosis von 250 μg/m2/Tag) können nach der Infusion verabreicht werden, bis eine erfolgreiche Transplantationsakzeptanz feststeht. Eine erfolgreiche Transplantationsakzeptanz gilt als eingetreten, wenn die Neutrophilenzahl des Patienten an zwei Folgetagen über 0,5 × 109 und 0,5×109 Zellen/L liegt und wenn die Blutplättchenzahl des Patienten an 7 Folgetagen über 20 × 109/L liegt. Prophylaktische Antibiotika werden gegeben, wenn die absolute Neutrophilenzahl unter 0,5 × 109 Zellen/L (orales Ciprofloxain (500 mg zweimal pro Tag) oder orales Penicillin VK (250 mg alle 6 Stunden) oder intravenöses Acyclovir (5 mg/kg alle 8 Stunden) liegt.
  • Abhängig von der Fähigkeit, Wirts- und Spendergewebe abzustimmen, können Immunsuppressionsmedikamente verabreicht werden, um Abstoßungsreaktionen zu verhindern.
  • BEISPIEL 8: Autologe Transplantation zur Behandlung genetischer Defekte
  • MNSC-Nachkommen werden aus neuralem Gewebe erzeugt, das aus einer Biopsie eines Patienten erhalten wurde, der an einer genetischen Erkrankung leidet, die die Blutzellen betrifft. Die MNSCs des Patienten werden in vitro mit Hilfe der in dem U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Verfahren stark vermehrt, um eine angereicherte Population multipotenter neuraler Stammzellen zu erhalten. Die MNSC-Nachkommen werden mit Hilfe bekannter Verfahren genetisch modifiziert, um den genetischen Defekt zu beheben. U.S. Pat. Nr. 5,760,012 beschreibt zum Beispiel Verfahren zur genetischen Modifizierung von hämtopoetischen Stammzellen bei Patienten, die unter Hämoglobinopathien wie Sichelzellenanämie, Beta-Thalassämie oder Gaucher-Krankheit leiden. Verfahren zur Behandlung von Sichelzellenanämie werden von Cole-Strauss, A., et al. (Science, 273: 1386–1389 (1996)) beschrieben. Die gleichen Verfahren können zum genetischen Modifizieren von MNSCs eines Patienten verwendet werden.
  • Die genetisch modifizierten MNSC-Nachkommen werden dem Patienten transplantiert. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, zuerst den Patienten mit Chemotherapie oder Strahlentherapie zu behandeln, um die erkrankte hämatopoetische Stammzellenpopulation des Patienten zu dezimieren. Die genetisch modifizierten MNSCs werden mit Hilfe der vorstehend in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren intravenös verabreicht.
  • BEISPIEL 9: Allogene Transplantation zur Verleihung von HIV-Resistenz
  • Es werden MNSC-Nachkommen aus dem aus einer Biopsie eines menschlichen Spenders erhaltenen neuralen Gewebes erzeugt, die die CCR5-Allele aufweisen, die nachweislich Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion verleiht (Samson et al., oben) und in vitro mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren stark vermehrt, um eine angereicherte Population menschlicher multipotenter neuraler Stammzellen zu erhalten. Mit Hilfe der in Beispiel 7 beschriebenen Vorgehen werden die MNSC-Nachkommen einem HIV-infizierten Patienten transplantiert, um ein Fortschreiten von AIDS zu verhindern oder zu beschränken. Alternativ können die MNSC- Nachkommen einem nicht infizierten Patienten transplantiert werden, um Immunität oder Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion zu verleihen.
  • BEISPIEL 10: Autologe Transplantation zur Verleihung von HIV-Resistenz
  • Von einem HIV-infizierten Patienten wird neurales Gewebe gewonnen. Unter Verwendung der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehensweisen werden in dem neuralen Gewebe vorhandene MNSCs in vitro stark vermehrt. Die MNSC-Nachkommen werden mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren genetisch modifiziert, um das endogene CCRS-Gen durch eine CCR5-Allele zu ersetzen, die nachweislich Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion verleiht (Samson et al., oben) Die genetisch modifizierten MNSC-Nachkommen werden dem Patienten mit Hilfe der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren transplantiert.
  • BEISPIEL 11: Autologe Transplantation bei Chemotherapiepatienten
  • Bevor ein Patient einer hochdosierten Chemotherapie unterzogen wird, wird eine neurale Gewebebiopsie des Patienten durchgeführt und die MNSCs werden in vitro vermehrt und mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehensweisen gelagert. Die Zellen werden dem Patienten nach der Chemotherapiebehandlung mit Hilfe der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren infundiert. Immunsuppressionsmedikamente sollten nicht erforderlich sein.
  • BEISPIEL 12: Xenoinkubation von MNSCs zur Erzeugung hämatopoetischer Zellen zur Reinfusion in Spenderspezien
  • Menschliche embryonale MNSCs, die aus dem Zwischenhirn eines Fötus oder Erwachsenen erhalten werden, werden in vitro mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehensweisen vermehrt. Nach mehreren Passagen werden Zellen aus 1 Woche alten Neurosphären erhalten. Es werden etwa 1 × 106 Zellen in die Schwanzvenen bestrahlter RAG-1-Mäuse injiziert, wie in Beispiel 4 dargestellt wird.
  • Man lässt die Tiere überleben, und in regelmäßigen Abständen wird Blut geerntet, um zu beweisen, dass menschliche MNSC das hämatopoetische System von Mäusen wiederbevölkern können. Die Fähigkeit der menschlichen neuralen Stammzellen, das hämatopoetische System von Mäusen wiederherzustellen, zeigt, dass MNSCs in andere Spezien von Säugern injiziert werden können, insbesondere in größere Tiere wie Schweine und Pferde, bei denen die MNSCs die Herstellung von neuen menschlichen Blutzellen dirigieren, die zur Verwendung in menschlichen Patienten geerntet werden können.

Claims (17)

  1. Verwendung von multipotenten neuralen Stammzellennachkommen von Säugetieren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Erzeugung von blutbildenden Zellen, wobei die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen dem Kreislaufsystem eines Säugetiers zu verabreichen sind.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für den Wiederaufbau des oder für das Hinzufügen zum blutbildenden System eines Tiers oder Menschen zu verwenden ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung aplastischer Anämie, Schwächen des Immunsystems, Autoimmunerkrankungen, das blutbildende System beeinflussende Krebsarten, Sichelzellenkrankheit und/oder Osteopetrose zu verwenden ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von blutbildenden Zellen zusätzlich das Platzieren der multipotenten neuralen Stammzellennachkommen in eine Umgebung umfasst, die die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen zur Erzeugung der blutbildenden Zellen veranlasst, wobei die Umgebung eine ex vivo Umgebung ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die multipotenten Stammzellennachkommen aus menschlichem Nervengewebe gewonnen werden.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen aus adultem, kindlichem oder fetalem Gewebe gewonnen werden.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen aus Nervengewebe gewählt aus der Gruppe bestehend aus Hirnrinde, Frontallappen, Conus medullaris, Hypothalamus, Kleinhirn, Mittelhirn, Hirnstamm, Rückenmark, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit und den die ZNS-Ventrikel umgebenden Geweben gewonnen werden.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen aus dem Säugetier gewonnen werden.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Verabreichung an das Kreislaufsystem des Säugetiers die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen genetisch modifiziert werden.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier einen genetischen Defekt aufweist, der eine oder mehrere Arten von blutbildenden Zellen beeinflusst, und dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen genetisch modifiziert werden, um den genetischen Defekt zu behandeln.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen von einem allogenen Spender oder einem xenogenen Spender gewonnen werden.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen eine angereicherte Population von multipotenten neuralen Stammzellen umfassen, wobei die angereicherte Population multipotenter neuraler Stammzellen mindestens 1% multipotente neurale Stammzellen umfasst.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die angereicherte Population multipotenter neuraler Stammzellen mindestens 10% multipotente neurale Stammzellen umfasst.
  14. Zusammensetzung für das Erzeugen neuer blutbildender Zellen in einem Patienten, wobei die Zusammensetzung eine Menge einer angereicherten Population multipotenter neuraler Stammzellen ausschließlich embryonaler Stammzellen, wobei die Menge eine Menge für das erfolgreiche Erzeugen blutbildender Zellen in einem diese Menge erhaltenden Säugetier ist, blutbildende Wachstumsfaktoren und eine physiologische Lösung umfasst.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, welche etwa 102 bis 107 Vorläuferzellen pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten umfasst.
  16. Darreichungsform für das Erzeugen neuer blutbildender Zellen in einem Patienten, welche eine die Zusammensetzung von Anspruch 14 enthaltende Vorrichtung umfasst, wobei die Vorrichtung für das Verabreichen der Zusammensetzung an das Kreislaufsystem eines Patienten geeignet ist.
  17. Darreichungsform nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Spritze oder einen Beutel für eine intravenöse Injektion umfasst.
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