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Prioritätsbegründende Anmeldungen
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Es
wird die Priorität
der U.S.-Anmeldung Nr. 09/100,679, eingereicht am 19. Juni 1998,
und der vorläufigen
U.S.-Anmeldung Nr. 60/060,289, eingereicht am 29. September 1997,
in Anspruch genommen.
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Gebiet der
Erfindung
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Das
Gebiet der Erfindung ist auf die Verwendung von aus neuralen Stammzellen
gewonnenen Zusammensetzungen für
die Reparatur, Rekonstitution oder Augmentation eines hämatopoetischen
(blutbildenden) Systems eines Säugers
gerichtet.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Verwendung von hämatopoetischen
Stammzellen und deren Nachkommen durch Knochenmarktransplantationen
zur Rekonstitution des hämatopoetischen
Systems wird zur Behandlung verschiedener blutbedingter Erkrankungen
und Störungen
wie aplastische Anämie,
Immunschwächen
und mehreren Arten von Krebs, darunter Lymphome und Leukämien (siehe
Bericht in Lu et al. Critical Rev. Onco/Hematol. 22: 61–78 (1996)),
eingesetzt. Die Knochenmarktransplantation wird sehr häufig in
dem Versuch eingesetzt, im Anschluss an ein Einwirken von myeloablativen
Mitteln, zum Beispiel nach Strahlentherapie oder Chemotherapie bei
der Behandlung verschiedener Krebsarten, die hämatopoetische Funktion wiederherzustellen.
Neben der Zerstörung
von Krebs können
diese Therapien auch zu Myelosuppression oder Myeloablation führen, was
wiederum zu Infektion, Blutungsstörungen und anderen Komplikationen
führen
kann. Neuere Schätzungen
deuten darauf hin, dass der Bedarf an Transplantation von aus Knochenmark
gewonnenen hämatopoetischen Stammzellen
bei einer Geschwindigkeit von 20% pro Jahr wächst und der Markt für das Produkt
bei etwa $500 Millionen pro Jahr liegt (Strickland, D. Bioworld
Today 8(14): 1).
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Leider
ist für
Patienten der Einsatz von Knochenmark-Transplantation als Therapie
sehr eingeschränkt.
Die Verwendung von hämatopoetischen
Zellen als Quelle von Zellen bei der Behandlung blutbedingter Störungen und
Erkrankungen ist mit mehreren Nachteilen behaftet. Der Erfolg einer
allogenen Transplantation hängt
für gewöhnlich davon
ab, einen Spender zu finden, der mit dem Rezipienten histokompatibel
und bereit ist, sich dem schmerzhaften und zeitaufwändigen Knochenmarkspendeprozess
zu unterziehen. Genetische Inkompatibilität kann zu zwei häufigen und
potentiell letalen Komplikationen führen. Zum einen wird zum Mindern
der Möglichkeit
einer Wirt-Transplantat-Reaktion das Immunsystem des Patienten durch
die Verwendung von immunsuppressiven Arzneimitteln beeinträchtigt,
was den Patienten sehr anfällig
für eine
Infektion macht. Zum anderen greifen die transplantierten Knochenmarkzellen
nach Festsetzen manchmal den Patienten in einer Transplantat-Wirt-Reaktion
an. Zusammen stellen diese beiden Faktoren die Hauptursachen für Sterbefälle und
Erkrankungshäufigkeit
von Patienten bei nicht-autologen Knochenmarktransplantaten dar.
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Optional
zu einer allogenen Transplantation kann manchmal unter der Voraussetzung,
dass der Patient gesund genug ist, um den Eingriff zu überstehen,
und das Mark brauchbar ist, das patienteneigene Knochenmark geerntet
und zur späteren
Verwendung aufbewahrt werden. Wenngleich die Verwendung eines solchen
autologen Systems im Allgemeinen die Gefahr einer mangelnden genetischen Übereinstimmung
ausschließt,
bestehen dennoch schwere Risiken aufgrund einer möglichen
nicht feststellbaren Verunreinigung mit bösartigen Zellen. Die zuverlässige Feststellung
und Eliminierung von transformierten Knochenmarkzellen muss erst
verwirklicht werden. Ein weiterer Nachteil dieses Ansatzes ist,
dass nur eine beschränkte
Menge an Knochenmarkzellen, die das hämatopoetische System vollständig wiederherstellen
können,
von einer Person geerntet werden können.
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Es
wurden große
Anstrengungen unternommen, Ex-vivo-Kultursysteme für hämatopoetische
Stamm- und Nachkommenzellen zum Zweck der Erzeugung einer ausreichenden
Menge an Zellen für
Transplantationszwecke aufzubauen. Die Beschaffung ausreichender
Mengen von hämatopoetischen
Stammzellen, entweder durch Knochenmarkbiopsie oder aus anderen
Quellen, ist aber eine Beschränkung
bei der Verwendung dieses Gewebes bei mit dem hämatopoetischen System verbundenen
Therapien. Bekannte Systeme erfordern komplexe Kulturbedingungen
und langwierige Zelltrennungsschritte und führen zu einer nur beschränkten Vermehrung
der Anzahl hämatopoetischer
Stammzellen. Siehe zum Beispiel U.S. Pat. Nr. 5,646,043 für Emerson
et al. Der größte Nachteil
ist die fehlende Fähigkeit,
die Stammzellen in vitro unter festgelegten Kulturbedingungen über einen
längeren
Zeitraum sequentiell zu passagieren, um die Zahl der für die Transplantation verfügbaren funktionsfähiger Zellen
zu vermehren. (Amos & Gordon,
oben; Lu, et al., oben). Folglich besteht ein ungebrochener Bedarf,
bei Therapien, die die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems betreffen,
autologe Stammzellen entweder wiederholt zu ernten oder kompatible
Spender anzuwerben.
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Aufgrund
der oben erwähnten
Komplikationen wurden andere Quellen für Stammzellen für eine hämatopoetische
Rekonstitution gesucht. Es wurde über Studien zum Einsatz von
fötalen
Leberzellen, neonatalen Milzzellen oder Thymuszellen berichtet.
(Amos & Gordon,
oben; Lu et al., oben). Die mit dem Einsatz dieser Zellarten verbundenen
ethischen Probleme machen ihre gewerbliche Verwendung weniger attraktiv.
Die Möglichkeit
des Erntens und Kryokonservierens von Nabelschnurblut wird derzeit
untersucht und kann ein annehmbareres Mittel zum Beschaffen von
Zellen für
spätere
Verwendung bieten (Broxmeyer et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 86: 3828). Bisher haben sich aus Nabelschnurblut gewonnene Zellen
aber nur als fähig erwiesen,
das hämatopoetische
System von Kindern erfolgreich neu zu bevölkern (Amos & Gordon, oben).
Die jüngste
Identifizierung von peripheren Blutnachkommenzellen (PBPC) mit Knochenmark
neubevölkernden
Fähigkeiten
hat den Weg für
neue Untersuchungen zur Verwendung von PBPC für die Transplantation geöffnet (diskutiert
in Lu et al., oben). Das Ernten dieser Zellen würde potentiell den Bedarf an
Knochenmarktransplantaten ersetzen. Bei diesem System sind aber
mehrere Nachteile ersichtlich: 1) das geerntete Blut kann verunreinigt
sein, 2) die Häufigkeit
der Erkrankung durch Transplantat-Wirt-Reaktion ist immer noch sehr
hoch, 3) zum Sammeln ausreichender zirkulierenden Stammzellen für eine vollständige hämatopoetische
Rekonstitution sind viele Leukapherese-Durchläufe erforderlich und 4) die
gesammelten Stammzellen können
nicht über lange
Zeiträume
in einem undifferenziertem Zustand gehalten werden.
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Aus
dem Vorstehenden wird offensichtlich, dass Alternativen zu den vorliegenden
Verfahren zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems eines
Patienten erforderlich sind.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen an die Hand
zu geben, die Vorläuferzellen
enthalten, die mühelos
erhalten und zur Erzeugung von hämatopoetischen
Zellen zur Verwendung bei der xenogenen, allogenen oder autologen
Transplantation verwendet werden können. Eine Aufgabe der Erfindung
besteht ferner darin, Zusammensetzungen an die Hand zu geben, die
mit Hilfe autologer Zellen erzeugt werden können, die einem Patienten während oder
im Anschluss an eine myeloablative Therapie zur Behandlung von blutbedingten
Störungen
wie Lymphomen und Leukämien,
Sichelzellenkrankheit, Osteopetrose usw. transplantiert werden können, wodurch
das Risiko des Transplantierens von erkrankten oder krebsartigen
Zellen vermieden und die Probleme des Stands der Technik mit Transplantatabstoßungen überwunden
werden.
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Die
vorliegende Erfindung verwirklicht diese Ziele durch Bereitstellen
von Zusammensetzungen, die multipotente neurale Stammzellennachkommen
enthalten, die zur Erzeugung hämatopoetischer
Zellen verwendet werden können.
Dadurch gibt die Erfindung eine neue medizinische Verwendung von
multipotenten neuralen Stammzellennachkommen zur Erzeugung von Zusammensetzungen
für die
Augmentation, Behandlung oder Veränderung des hämatopoetischen
Systems eines Patienten an die Hand. Ein Verfahren für das Erzeugen
hämatopoetischer
Zellen aus multipotenten neuralen Stammzellennachkommen eines Säugers umfasst
das Setzen der multipotenten neuralen Stammzellennachkommen in eine
Umgebung, beispielsweise das Kreislaufsystem eines Patienten, die
die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen anregt, hämatopoetische
Zellen zu erzeugen. Das Verfahren kann zur Behandlung eines Patienten
verwendet werden, der sich einer myeloablativen Therapie, beispielsweise
Strahlentherapie, Chemotherapie oder einer Kombination beider, unterziehen
wird oder bereits unterzogen hat und daher unterdrückte oder
dezimierte endogene hämatopoetische
Stammzellen hat. Das Verfahren kann auch zur Behandlung eines Patienten
eingesetzt werden, der unter einem genetischen Defekt leidet, der
hämatopoetische
Zellen beeinträchtigt,
indem multipotente neurale Stammzellennachkommen transplantiert
werden, die von einem Spender mit normalen hämatopoetischen Zellen erhalten
wurden, oder indem genetisch modifizierte Zellen verabreicht werden,
die für
den Patienten autolog, allogen oder xenogen sein können. Ferner
kann das Verfahren zur Behandlung normalern Patienten verwendet
werden, um diesen ein supranormales hämatopoetisches System zu geben
oder ihnen ein hämatopoetisches
System mit gegenüber
dem Normalzustand zusätzlichen
Eigenschaften oder Funktionen zu geben.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1:
Direkte Darstellung von transplantierten multipotenten neuralen
Stammzellennachkommen (NSC) mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie.
Milzzellensuspensionen einer Kontrollgruppe nicht bestrahlter ROSA26
und Balb/c (Reihen 1–3)
sowie von bestrahlten Rezipientenmäusen (Reihen 4–6) wurden
auf Deckgläser
mit einer Cytospin zentrifugiert. Die Zellen wurden für H-2Kb (rot) und einen der hämtopoetischen phänotypischen
Marker (grün)
doppelmarkiert. Die doppelmarkierten Zellen zeigten sich gelb und
zeigen sich in 1 als dunkelgraue oder schwarze
Zellen. Die doppelmarkierten Zellen fehlten in der Milz von nicht
bestrahlen Balb/c-Mäusen
(Reihe 1) und in der Milz von EBSS-injizierten Kontrolltieren (Reihe
2). Eine große
Menge von doppelmarkierten Zellen fand sich in den nicht bestrahlen
ROSA26-Kontrolltieren (Reihe 3) sowie in Tieren, denen ROSA-Knochenmark (Reihe
4) oder embryonale NSC (Reihe 5) oder adulte NSC (Reihe 6) injiziert worden
war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die multipotenten neuralen Stammzellennachkommen
die Fähigkeit
haben, das beeinträchtigte
hämatopoetische
System wieder zu bevölkern.
(Vergr. 630fach).
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2A–2F:
Clonogene In-vitro-Tests von Knochenmark, das aus Tieren gewonnen
wurde, die entweder embryonale oder adulte neurale Stammzellen erhalten
hatten, lassen neurale Stammzellentransplantat-Akzeptanz im Mark
erkennen. Zur Ermittlung der Klone, die von neuralen Stammzellen
stammten, wurde X-gal-Histochemie eingesetzt. Eine große Anzahl
an Klonen, die sich aus Embryonalen (A = 50fache Vergr.; B = 200fache
Vergr.) oder Adulten (C = 50fache Vergr.; D = 200fache Vergr.) bildeten,
wurden nach einer X-gal-Exposition von 8 Stunden blau und zeigen
sich in den 2A–2F als
dunkelgraue oder schwarze Klone. In dem Mark von sowohl embryonalen
(E) als auch adulten (F) Mäusen
gab es eine Anzahl von Klonen, die sich bei X-gal-Exposition nicht
blau färbten,
was einen geringen Wert früher
endogener hämatopoetischer Zelltypen
anzeigt. In den 2E und 2F verfärbten sich
die mit Pfeilen markierten kleineren Klone bei X-gal-Exposition nicht blau. Die Maßstabsbalken
sind 100 μm
(A, C, E & F)
sowie 40 μm
(B & D).
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Eingehende
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt in der signifikanten Entdeckung, dass
multipotente neurale Stammzellen (MNSCs), die in vitro stark vermehrt
werden können,
wie in WO 93/01275 und in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschrieben, hämatopoetische
Nachkommen erzeugen können.
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Wenn
sich eine MNSC teilt, lässt
sie eine Tochter-MNSC entstehen, und ist dadurch zu Selbsterhaltung
fähig.
Sie kann auch eine Progeniturzelle entstehen lassen, die eine dazu
bestimmte undifferenzierte Zelle ist, einen bestimmte differentiativen
Weg entstehen lassen. Eine neuronale Progenitorzelle kann sich zum Beispiel
beschränkt
oft teilen; die sich ergebenden Nachkommen differenzieren sich dann
zu Neuronen. Progenitorzellen sind vor der Differenzierung für gewöhnlich zu
einer finiten Anzahl von Zellteilungen fähig und sind daher im Gegensatz
zu Stammzellen nicht zur Selbsterhaltung fähig. Die undifferenzierten
Nachkommen von MNSCs, die hier als „Vorläuferzellen" bezeichnet werden, umfassen Tochter-MNSCs
und determinierte Progenitorzellen. Der Betriff „multipotente neurale Stammzelle" („MNSC") bezeichnet eine
Zelle, die zu einer weit reichenden Selbsterneuerung fähig ist,
d.h. fähig
ist, sich während
Zellteilung über
einen längeren
Zeitraum selbst zu ersetzen, und alle wichtigen Zellarten des Gewebes
erzeugen kann, in dem sie sich befindet (d.h. Neuronen, Astrozyten
und Oligodendrozyten). Mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376
beschriebenen Kulturverfahren können
MNSCs induziert werden, sich in vitro in einem festgelegten, Wachstumsfaktor
enthaltenden Kulturmedium stark zu vermehren. Die Nachkommen jeder
MNSC können
sich differenzieren, um Astrozyten, Oligodendrozyten und Neurone
zu bilden. Die MNSCs können
kontinuierlich in Kultur vermehrt werden, um große Mengen an Nachkommen zu
erzeugen, ohne dass die Zellen mit Onkogenen umgewandelt werden müssen oder
die Zellen aus tumorigenem Gewebe gewonnen werden müssen. Dies
macht die Zellen für
therapeutische Anwendungen besonders erwünscht. Die MNSC-Nachkommen können mit
Hilfe von Tieftemperaturtechnik oder anderen auf dem Gebiet bekannten
Verfahren gelagert werden, bis sie benötigt werden.
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Der
Begriff „hämatopoetische
Zelle" bezeichnet
eine beliebige Art von Zelle des hämatopoetischen Systems, einschließlich aber
nicht ausschließlich
undifferenzierte Zellen wie hämatopoetische
Stammzellen und Progenitorzellen und differenzierte Zellen wie Megakaryozyten,
Erythrozyten, Leukozyten, Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten und
natürliche
Killerzellen.
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Bei
Setzen in eine geeignete Umgebung, so wie sie hier beschrieben wird,
kann eine MNSC induziert werden, sich stark zu vermehren und Nachkommen
zu erzeugen, die sich zu Zellen des hämtopoetischen Systems differenzieren.
Wenn hier Bezug auf die Umgebung gemacht wird, in die MNSC-Nachkommen
gegeben werden, wird an die allgemeine Bedeutung des Begriffs „Umgebung" gedacht. Der Begriff
bezeichnet somit die Kombination von externen oder von außen wirkenden
physikalischen Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung
multipotenter neuraler Stammzellen und/oder deren Nachkommen beeinträchtigen
und beeinflussen. Die Umgebung kann ex vivo oder in vivo sein. Undifferenzierte
MNSC-Nachkommen regenerieren bei Transplantation in das Kreislaufsystems
eines unter Myeloablation leidenden Säugers mit Hilfe der gleichen Transplantationsverfahren,
die auf dem Gebiet für
Knochenmark- und hämatopoetische
Stammzellen-Transplantationen bekannt sind, die ganze Spannweite
der verschiedenen Blutzellen und stellen das hämatopoetische System des Säugers wieder
her. Dadurch ist ein Kreislaufsystem eines Säugers ein Beispiel einer In-vivo-Umgebung,
die MNSCs zur Erzeugung von Zellen des hämatopoetischen Systems induziert.
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Die
Transplantation von undifferenzierten MNSC-Nachkommen hat gegenüber dem
Transplantieren von Knochenmark oder gezüchteten hämatopoetischen Stammzellen
mehrere Vorteile. Ein Vorteil ist, dass bei Transplantieren von
undifferenzierten neuralen Vorläuferzellen
das Risiko einer Transplantat-Wirt-Erkrankung wesentlich geringer
ist, da keine lymphoiden Zellen transplantiert werden. Ferner ist
man der Meinung, dass MNSCs an ihrer Oberfläche weniger oder gar keine
Moleküle
des Haupthistokompatibilitätskomplexes
(MHC) aufweisen. Es wurde gezeigt, dass MHC-Moleküle an der Oberfläche von
MNSCs von Mäusen
fehlen und auch an der Oberfläche
von MNSCs anderen Spezien fehlen können (siehe Molluk, A., New
Scientist, S. 40 (1998)). Bei der autologen Transplantation besteht
ein anderer Vorteil der Verwendung von MNSC-Nachkommen für das Wiederbevölkern des
hämatopoetischen
Systems eines Patienten darin, dass während oder im Anschluss an
Chemotherapie oder Strahlentherapie zur Behandlung von Leukämien und
anderen blutbedingten Erkrankungen das Risiko des Wiedereinschleppens
von bösartigen
oder erkrankten hämatopoetischen Zellen
eliminiert wird.
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Ein
anderer Vorteil bei der Verwendung von MNSC-Nachkommen ist, dass
festgelegte Kulturbedingungen, die bereits in der Literatur beschrieben
wurden, zum Induzieren der Vermehrung von MNSCs verwendet werden
können,
um problemlos eine große
Anzahl an MNSC-Nachkommen aus einer kleinen Ausgangsgewebemenge
zu erzeugen.
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Jedes
Gewebe, das MNSCs enthält,
kann verwendet werden. Derzeit ist die Verwendung neuralen Gewebes
aus jedem MNSCs enthaltenden neuralen Gewebe, einschließlich aber
nicht ausschließlich
die Großhirnrinde,
der Stirnlappen, der Conus medullaris, das Kleinhirn, das Mittelhirn,
der Gehirnstamm, das Rückenmark,
die Rückenmarksflüssigkeit
und das die Ventrikel des zentralen Nervensystems (ZNS) umgebende Gewebe,
bevorzugt. Für
autologe Transplantationszwecke können diese Gewebe durch Biopsie
erhalten werden.
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Die
MNSCs können
in vitro kontinuierlich stark vermehrt und passagiert werden, um
große
Zahlen von Zellen für
Transplantationszwecke mit Hilfe bereits auf dem Gebiet bekannter
Verfahren zu erzeugen. Zum Vergleich: vorbekannte Verfahren für die In-vitro-Erzeugung von
hämatopoetischen
Stammzellen erfordern oft komplexe Kulturbedingungen und langwierige
Zelltrennschritte und führen
zu einer nur beschränkten
Vermehrung der Zahlen hämatopoetischer
Stammzellen. U.S. Pat. Nr. 5,646,043 und U.S. Pat. Nr. 5,612,211
geben zum Beispiel beide Verfahren für ein beschränktes Maß an In-vitro-Erneuerung
von hämatopoetischen
Stammzellen an die Hand.
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Geeignete
Verfahren für
das Erhalten und Vermehren von MNSCs in Kultur zum Gewinnen angereicherter
Populationen von multipotenten neuralen Stammzellen werden in U.S.
Pat. Nr. 5,750,376 beschrieben, das hiermit durch Erwähnung Bestandteil
dieser Erfindung wird. Der Ausdruck „angereicherte Population
multipotenter neuraler Stammzellen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet
eine Population von Zellen, die einen höheren Prozentsatz an MNSCs
enthält,
als in dem Gewebe vorhanden sind, aus dem die MNSCs stammen. Typischerweise
sind weniger als etwa 0,1% der von einem neuralen Gewebe eines Säugers erhaltenen
Zellen MNSCs. Daher enthält
eine angereicherte MNSC-Population, die etwa 1% MNSCs enthält, typischerweise mindestens
zehnmal mehr MNSC als in dem neuralen Gewebe vorhanden sind, aus
dem die MNSCs abstammen. Sekundäre
und folgende MNSC-Kulturen, die nach den in U.S. Pat. Nr. 5,750,376
offenbarten Verfahren erzeugt wurden, liefern im Allgemeinen geeignet
angereicherte Populationen von MNSCs. Zur Verwendung bei der Wiederbevölkerung
des hämatopoetischen
Systems eines Patienten umfasst die angereicherte MNSC-Population vorzugsweise
mindestens 1% MNSCs. Bevorzugter sind mindestens etwa 5% der Zellen
MNSCs. Noch bevorzugter ist die Verwendung einer angereicherten
Population von MNSCs, die mindestens 10% MNSCs umfasst. Es ist möglich, angereicherte
MNSC-Populationen zu erhalten, die mindestens 20% MNSCs enthalten.
Die Verwendung von hoch angereicherten MNSC-Populationen, die mindestens
15% oder in manchen Fällen
20% MNSCs enthalten, kann wünschenswert
sein, da es die Gesamtzell der für
die Transplantation erforderlichen Zellen verringern kann.
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Der
Prozentsatz an in einer Kultur vorhandenen MNSCs kann durch Passagieren
einer bekannten Anzahl an Zellen von der Kultur zu einem frischen
Kulturmedium mit einem oder mehrere Wachstumsfaktoren, der eine
starke Vermehrung von multipotenten neuralen Stammzellen induziert,
beispielsweise Epidermis-Wachstumsfaktor
(EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), geschätzt werden.
Der Prozentsatz an Zellen, die Neurosphären bilden, zeigt den ungefähren Prozentsatz
der in der Kultur vorhandenen Stammzellen an. Der Begriff „Neurosphäre" bezeichnet ein Aggregat
von Vorläuferzellen,
das sich bildet, wenn eine MNSC zu starker In-vitro-Vermehrung induziert
wird. Eine Neurosphäre
umfasst die Nachkommen einer einzigen MNSC, was die Tochter-MNSCs
und undifferenzierte Progenitorzellen einschließt. U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschreibt
Neurosphären
näher und
zeigt Fotographien von Neurosphären.
Um die Kultur für
MNSCs weiter anzureichern, können
Zellsortierverfahren eingesetzt werden, indem determinierte Progenitorzellen
von MNSCs getrennt werden.
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Undifferenzierte
MNSC-Nachkommen können
in eine „Hämatopoetisch-induzierende
Umgebung" gegeben
werden, die ihre Differenzierung zu hämatopoetischen Zellen induziert.
Der Begriff „hämatopoetisch-induzierende
Umgebung" umfasst
alle Ex-vivo-Kulturbedingungen
oder -behandlungen bzw. jeden Ort in vivo eines Wirts oder Patienten,
der MNSCs anregt, hämatopoetische
Zellen zu erzeugen. Bei einer Ex-vivo-Kultur können abhängig von
dem erwünschten
Phänotyp
neurale Stammzellen-Nachkommen
durch Abwandlung der Kulturumgebung zur Differenzierung entlang
einer bestimmten Linie induziert werden, und zwar durch Zugabe von
einem oder mehreren Wachstumsfaktoren oder Cytokinen oder Kombinationen
davon und/oder gemeinsame Kultur der Zellen mit Zellen ausgewählter Zelllinien
oder mit einer Zellschicht, die eine Wachstumsunterlage bietet und/oder
von außen
wirkende Faktoren in das Kulturmedium freisetzt, die den difterentiativen
Weg der MNSC-Nachkommen
beeinflussen. Ferner kann eine Manipulation des Substrats, auf dem
die Zellen gezüchtet
werden, entweder vor der Transplantation oder nach erfolgter Transplantation,
das phänotypische
Ergebnis einer Population von Zellen beeinflussen. Es können auf
dem Gebiet bekannte Kultivierungsverfahren zur Beeinflussung der
Differenzierung der MNSC-Nachkommen eingesetzt werden, wie sie zum
Beispiel zum Beeinflussen der difterentiativen Determination der
Nachkommen früher
embryonaler Blastula-Stammzellen bekannt sind (siehe Keller, G.
B. (1995) Curr. Opin. Cell Biol. 7: 862–869). Dadurch können Ex-vivo-Verfahren zum
Liefern einer Population von MNSC-Nachkommen verwendet werden, die
für das
Vorhandensein neu erzeugter, undifferenzierter oder gezielt differenzierter
Nachkommen der neuralen Stammzellen angereichert ist. Die vorbehandelten
Zellen können
im undifferenzierten Zustand transplantiert werden oder können alternativ differenziert
sein oder sich im Prozess der Differenzierung zu spezifischen Zelltypen
befinden, bevor sie transplantiert werden. Es können andere auf dem Gebiet
für das
Kultivieren von hämatopoetischen
Zellen bekannte Kulturbedingungen eingesetzt werden, wie sie zum
Beispiel in den U.S. Patenten Nr. 5,612,211 und 5,646,043 beschrieben
werden.
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Beispiele
für in
vivo hämatopoetisch-induzierende
Umgebungen umfassen Kreislaufsystem, Milz, Thymus etc. eines Säugetiers.
Undifferenzierte MNSC-Nachkommen
zum Beispiel, die mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen
Vorgehen erzeugt wurden, können
einem Patienten ohne weitere Ex-vivo-Manipulation
systemisch verabreicht werden. Das eigene Kreislaufsystem des Patienten
liefert die Umgebung, die MNSC-Nachkommen zur Erzeugung von Zellen
des hämatopoetischen
Systems induziert. Die neuralen Stammzellen bevölkern in Reaktion auf Umgebungssignale
automatisch verloren gegangene oder fehlerhaft funktionierende Zelltypen
neu. Die MNSC-Nachkommen können
auch dem Kreislaufsystem eines gesunden Säugers verabreicht werden und
werden dadurch für
den Zweck der Augmentation eines normal funktionierenden hämatopoetischen
Systems verwendet. Auf diese Weise dienen die MNSC-Nachkommen als
Reservevorrat von Zellen, die bis zu dem Zeitpunkt, da sie benötigt werden,
undifferenziert bleiben.
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Ein
weiteres Beispiel einer in vivo hämatopoetisch-induzierenden
Umgebung ist das Kreislaufsystem eines Wirtstiers. Eine angereicherte
Population von menschlichen MNSCs kann mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten
Kulturbedingungen erzeugt werden und einem Wirtssäugetier
systemisch verabreicht werden, wobei die hämatopoetisch-induzierende Umgebung
des Kreislaufsystems des Wirtstiers die MNSCs induziert, Zellen
des menschlichen hämatopoetischen
Systems zu erzeugen. Die menschlichen MNSCs können vor der Verabreichung
in das Wirtssäugetier
optional genetisch modifiziert werden, wie nachstehend näher beschrieben
wird.
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Ferner
kann das endogene hämatopoetische
System des Wirtssäugetiers
optional vor der Verabreichung der menschlichen MNSCs beeinträchtigt worden
sein, zum Beispiel durch Bestrahlung oder eine andere geeignete
Behandlung. Nachdem im Wirtstier eine ausreichende Menge menschlicher
hämatopoetischer
Zellen erzeugt wurde, werden sie entnommen und in einen menschlichen
Patienten transplantiert. Wenn das Wirtstier und der Patient unterschiedliche
Spezien sind, wird dieser Prozess als „Xenoinkubation" bezeichnet.
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Vor
der Transplantation können
MNSC-Nachkommen auch genetisch modifiziert werden, um die Symptome
einer speziellen Erkrankung zu lindern oder um den verschiedenen
Nachkommen bei Implantation in Individuen ohne Erkrankung neue Funktionen
zu verleihen. Die Zellen könnten
zum Beispiel ein erwünschtes Gen
enthalten, beispielsweise ein Gen, das ein fehlendes Protein, ein
krankheitsresistentes Protein oder ein anderes vorteilhaftes Protein
exprimieren könnte.
Im Gegensatz zu den anderen Stammzellensystemen, wie ein hämatopoetisches
Stammzellensystem, können
MNSCs induziert werden, sich unter geeigneten In-vitro-Kulturbedingungen
kontinuierlich zu teilen, was sie zu ausgezeichneten Zielen für genetische
Modifizierung macht. Der hier verwendete Begriff „genetische
Modifizierung" bezeichnet
die stabile oder transiente Änderung des
Genotyps einer Vorläuferzelle
durch absichtliches Einbringen von exogener DNA. Der Begriff schließt auch das
Maskieren oder die Deletion eines schädlichen oder unerwünschten
Gens ein. DNA kann synthetisch oder natürlich gewonnen sein und kann
Gene, Teile von Genen oder andere brauchbare DNA-Sequenzen enthalten.
Verfahren für
die genetische Modifizierung von Zellen sind auf dem Gebiet wohlbekannt,
und Verfahren für
die genetische Modifizierung von MNSC-Nachkommen werden in U.S. Pat. Nr. 5,750,376
offenbart. Es kann erwünscht
sein, die MNSC-Nachkommen genetisch zu modifizieren, wenn sie zur
Transplantation in einen Patienten zur Linderung der Symptome einer
bestimmten Krankheit mit genetischer Grundlage verwendet werden
sollen. Die Zellen können
vor der Transplantation mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens, wie
homologe Rekombination, genetisch modifiziert werden. Mit Hilfe
von auf dem Gebiet bekannten Verfahren können zum Beispiel neurale Stammzellen
umgewandelt werden, um die Allele des Chemokin-Rezeptorgens, CCR5,
zu exprimieren, die Immunität
gegenüber
HIV verleiht. Die Zellen werden dann einem AIDS-Patienten (der im
allgemeinen ein beeinträchtigtes
hämatopoetisches
System hat) verabreicht und lassen T-Zellen entstehen, die gegen
eine Infektion mit HIV resistent sind (Paxton et al., Nature Medicine
2(4): 412–417
(1996); Liu Rong et al, Cell 86: 367–377 (1996) und Samson et al.,
Nature 382: 722–725
(1996)).
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Knochenmarktransplantate
werden zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten verwendet,
einschließlich
aber nicht ausschließlich
aplastische Anämie,
Immunsystemschwächen,
Autoimmunerkrankungen, das hämatopoetische
System beeinträchtigende
Krebsarten wie Lymphome und Leukämien,
Sichelzellenkrankheit, Osteopetrose usw. (siehe O'Reilly, R. J., Blood
62: 941–964
(1983); Thomas, E. D. Blood Cells, 17: 259–267 (1991); und Marmont, A.
M. Bone Marrow Transplant 11: 3–10
(1993)). Die Transplantation von MNSC-Nachkommen kann an Stelle
von Knochenmark zur Behandlung dieser Krankheiten eingesetzt werden. Ferner
kann die intravenöse
Verabreichung von MNSC-Nachkommen in Patienten mit Autoimmunerkrankungen
die Symptome der Erkrankung lindern (siehe Kenyon, N. S., IBC on
Hematopoietic Stem Cells (1997)). MNSC-Nachkommen können auch
durch von außen
wirkende oder epigenetische Mittel verändert und in normale bzw. nicht
erkrankte Individuen implantiert werden, um ihnen ein hämatopoetisches
System mit supranormalen Funktionen zu verleihen.
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Sobald
geeignete Mengen an MNSC-Nachkommen, die für einen bestimmten Zweck erforderlich
sind, gewonnen sind, werden sie mit Hilfe von Behandlungsformen,
die dem Fachmann auf dem Gebiet für die Transplantation von hämatopoetischen
Stammzellen bekannt sind, in einen Patienten transplantiert. Für die Behandlung
von Menschen gibt es auf dem Gebiet viele Information über Verfahren
für die
Transplantation von hämatopoetischen
Stammzellen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen (Bensinger
et al. J. of Clin. Oncoloy, 13(10): 2547–2555 (1995); und Tricott et
al., Blood 85(2): 588–596).
Diese Literaturangaben beschreiben klinische Versuche für die Transplantation
von autologen peripheren Blutstammzellen für die Rekonstitution des hämatopoetischen
Systems eines Patienten. Diese Studien zeigten, dass eine Infusion
von etwa 2 × 106 bis 5,0 × 106 CD34+ Zellen pro Kilogramm Patient zu einer schnelleren
Transplantatakzeptanz führt,
als wenn weniger CD34+ Zellen verabreicht
werden. Weniger als etwa 1% der unfraktionierten Zellen, die aus
peripherem Blut gewonnen werden, sind CD34+ (Lu et al., oben). Es wird
geschätzt,
dass etwa 1–5%
dieser CD34+ Zellen hämatopoetische
Stammzellen sind. Zum Vergleich: man schätzt, dass etwa 10–20% von
sequentiell passagierten Vorläuferzellen,
die mit Hilfe der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Verfahren vermehrt
werden, MNSCs sind. Daher sollte die Rekonstitution des hämatopoetischen
Systems eines Patienten mit Hilfe von MNSC-Nachkommen unter Verwendung
von weniger Zellen als bei den bisherigen Verfahren verwendet möglich sein.
Dies ist vorteilhaft, da die Verabreichung von weniger Zellen weniger
Kryokonservierungsmittel in den Patienten einbringt (unter der Annahme,
dass die transplantierten Zellen zuvor gefroren waren). Ein weiterer
Vorteil ist, dass dem Patienten weniger Volumen verabreicht wird
und dieses gegenüber
der länger
dauernden Infusion, die für
die Verabreichung von peripheren Blutstammzellen erforderlich ist,
als Bolusdosis zugeführt
werden kann (z.B. Bensinger et al., oben und Tricott et al, oben).
-
Etwa
102 bis 107 und
noch typischer etwa 103 bis 106 neurale
Vorläuferzellen/kg
Körpergewicht
sollten für
die Rekonstitution des hämatopoetischen
Systems eines menschlichen Patienten, der sich einer myeloablativen
Therapie unterzogen hat, reichen. Die optimale Anzahl an Zellen
kann mit Hilfe von routinemäßigen klinischen
Versuchen ermittelt werden. Die Anzahl benötigter Zellen kann bei einem
Patienten, der ein nur teilweise zerstörtes hämatopoetisches System aufweist,
anders sein. Klinische Versuche ähnlich
denen, wie sie von Tricott et al., oben, und Bensinger et al., oben,
beschrieben werden, können
zur Ermittlung geeigneter Behandlungsformen für verschiedene Patientenpopulationen
verwendet werden.
-
Die
Vorläuferzellen
werden durch ein geeignetes Verfahren, beispielsweise intravenöse, subkutane oder
intraperitoneale Injektion oder Infusion, in das Kreislaufsystem
des Rezipienten eingebracht. Die intravenöse Injektion oder Infusion
sind derzeit die bevorzugten Verfahren. Im Allgemeinen wird eine
Zusammensetzung hergestellt, die die Vorläuferzellen und eine physiologische
Lösung
umfasst, beispielsweise Kochsalzlösung, die zur Verwendung als
Träger
für die
Verabreichung der Vorläuferzellen
in das Kreislaufsystem geeignet ist. Die Zellen können zuerst
in der Lösung
gespült
werden, um restliches Kulturmedium zu entfernen, oder um bei frisch
aufgetauten Zellen restliches Kryokonservierungsmittel zu entfernen.
Wenn die MNSC-Nachkommen gefroren waren, ist es bevorzugt, sie aufzutauen,
sie in vitro in einem Wachstumsmedium zu kultivieren (d.h. in einem
Wachstumsfaktoren enthaltenden Medium, die starke MNSC-Vermehrung
induzieren) und sie mindestens einmal vor der Transplantation zu
passagieren. Dies gewährleistet
die Lebensfähigkeit
der Zellen und entfernt überschüssiges Kryokonservierungsmittel.
Die Endkonzentration der Vorläuferzellen
ist nicht entscheidend, solange eine ausreichende Anzahl an Vorläuferzellen
verabreicht wird. Für
eine einfachere Verabreichung und zum Komfort des Patienten ist
es für
gewöhnlich
bevorzugt, das Gesamtvolumen der verabreichten Zellsuspension zu
minimieren, solange die Zellen dem Patienten ohne Verklumpen mühelos injiziert
oder infundiert werden können.
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Die
Endkonzentration liegt im Allgemeinen in dem Bereich von etwa 107 bis 109 Vorläuferzellen/ml.
Die Zusammensetzung aus physiologischer Lösung/Vorläuferzellen kann weiterhin hämatopoetische
Wachstumsfaktoren wie Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden
Faktor (GM-CSF) oder Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktor
(G-CSF) umfassen, um den Zeitraum zu beschleunigen, in dem bestimmte
Zelltypen erzeugt werden. Alternativ können dem Patienten Wachstumsfaktoren
vor oder nach der Verabreichung der Vorläuferzellen verabreicht werden.
Vor der Transplantation wird eine Dosisform hergestellt, die eine
die Zusammensetzung aus Vorläuferzellen/physiologischer
Lösung
enthaltende Vorrichtung umfasst. Die Vorrichtung kann jede Vorrichtung
sein, die für
die Zufuhr der Vorläuferzellen
zu einem Patienten geeignet ist. Solche Vorrichtungen können Spritzen,
Infusionsbeutel oder ähnliche
Behälter
für die
intravenöse
Verabreichung der Vorläuferzellenzusammensetzung
an den Patienten umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt.
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Wie
nachstehend in Beispiel 4 unter Verwendung eines Mausmodells genauer
erläutert
wird, führt
die Transplantation von MNSC-Nachkommen in Rezipienten, die einer
Ganzkörperbestrahlung
unterzogen wurden, um die funktionsfähigen hämatopoetischen Stammzellen
zu dezimieren, zur Rekonstitution des hämtopoetischen Systems. Man
meint, dass der Vorgang in den meisten Fällen zu einer permanenten Wiederherstellung
des hämatopoetischen
Systems führt.
Bei einigen Erkrankungen können
aber wiederholte Transplantationen erforderlich sein.
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Es
geht aus der Beschreibung dieser Anmeldung und den nachstehenden
Beispielen hervor, dass die MNSC-Nachkommen eine ideale Alternative
zur derzeitigen Verwendung von hämatopoetischen
Stammzellen zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems oder
deren Zugeben zum hämatopoetischen
System eines Tiers oder Menschen darstellen.
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Alle
zitierten Quellennachweise, Patente und Patentanmeldungen werden
durch Erwähnung
in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung. Die folgenden
Beispiele und Zeichnungen dienen lediglich der Veranschaulichung
und sollen in keiner Weise als Beschränkung des Schutzumfangs der
Erfindung ausgelegt werden.
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BEISPIEL 1: Erhalten von
MNSCs aus Neuralgewebe
-
A. Embryonales Gewebe
-
Striatales
Gewebe aus den Gehirnen von 14 Tage alten CD1- und TGR-ROSA-Mäuseembryos (Charles River)
wurde mit Hilfe eines sterilen Eingriffs entnommen. Das Gewebe wurde
mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette in serumfreies Medium bestehend
aus einem 1:1-Gemisch von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)
und F-12-Nährstoff
(Gibco) mechanisch aufgespalten. Die aufgespaltenen Zellen wurden bei
800 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand angesaugt und die
Zellen in DMEM/F-12-Medium zum Zählen
resuspendiert.
-
B. Adultes Gewebe
-
Striales
Gewebe aus den Gehirnen von adulten TGR-ROSA-Mäusen (diese Tiere sind mit β-Gal genetisch
markiert, was die Detektion in Wirtstieren erlaubt), RAG-1-Mäusen (Stamm von Mäusen mit
Nullmutation, die keine reifen, funktionsfähigen B- und T-Blutzellen erzeugen können, negative
Kontrollsphären)
und C57BL/6J-Mäusen
(Hintergrundzuchtmaterial für
RAG-1-Mäuse
mit Nullmutation). Die Stammzellen von TGR-ROSA- und C57BL/6J-Tieren,
aber nicht von RAG-1-Mäusen,
sollten die B- und T-Blutzellenkompartimente von Wirtstieren rekonstituieren
können.
Diese Gewebe wurden entfernt und in 500 μl große Abschnitte zerlegt und sofort
in calciumarme, mit Sauerstoff angereicherte künstliche Rückmarkflüssigkeit (Ca2+-armer aCSF) übertragen,
die 1,33 mg/ml Trypsin, 0,67 mg/ml Hyaluronidase und 0,2 mg/ml Kynurensäure enthielt. Das
Gewebe wurde in dieser Lösung
90 Minuten lang bei 32°C–35°C gerührt. aCSF
wurde abgegossen und durch frisches, mit Sauerstoff angereichertes
aCSF 5 Minuten lang ersetzt. Das Gewebe wurde in eine DMEM/F-12/10%-Hormonlösung, die
0,7 mg/ml Ovomucoid enthielt, übertragen
und mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette vermahlen. Die Zellen
wurden bei 400 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand
angesaugt und die granulierten Zellen wurden in dem DMEM/F-12/10%-Hormongemisch
resuspendiert.
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BEISPIEL 2: Herstellung
angereicherter MNSC-Populationen
-
Aus
Beispiel 1 erhaltene adulte Zellen wurden in nicht beschichteten
35-mm-Petrischalen
(Costar), die Complete Medium, 10 ng/ml bFGF und 20 ng/ml EGF [gereinigt
aus Mäuseunterkieferdrüse (Collaborative
Research) oder menschlicher Rekombinante (Gibco/BRL)] enthielten,
plattiert. Embryonale Zellen, die mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen
gleichen Verfahren gewonnen wurden, wurden in dem gleichen Kulturmedium gezüchtet, mit
der Ausnahme, dass kein bFGF zugegeben wurde. Complete Medium ist
ein serumfreies Medium bestehend aus DMEM/F-12 (1:1), das Glucose
(0,6%), Glutamin (2 μM),
Natriumbicarbonat (3 mM) und HEPES (4-[2hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure)-Puffer
(5 mM) (alle von Sigman, mit Ausnahme des Glutamin [Gibco]) enthält. Complete
Medium wird ein festgelegtes Hormongemisch und Salzgemisch (Sigma) zugesetzt,
das Insulin (25 μg/ml),
Transferrin (100 μm/ml),
Progesteron (20 nM), Tetramethylendiamin (60 μM) und Selenchlorid (30 nM)
umfasst. Die in den Kulturen vorhandenen murinen MNSCs vermehrten
sich stark, was Neurosphären
entstehen ließ.
-
Nach
6–7 Tagen
in vitro ließ man
die Neurosphären
in der unteren Ecke des Kolbens absetzen. Die Neurosphären wurden
dann in 50 ml große
Zentrifugengläser übertragen
und bei 300 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Medium wurde
abgesaugt und die Neurosphären
wurden in 1 ml des Proliferationsmediums resuspendiert, in dem sie
gezüchtet
worden waren. Die Neurosphären
wurden mit einer feuerverengten Pasteuer-Pipette aufgespalten und
pulverisiert, um eine einzellige Suspension zu bilden. Die Zellen
wurden gezählt
und bei 50.000 Zellen/ml in Complete Medium erneut ausplattiert.
Neue Neurosphären
bildeten sich nach ein paar Tagen. Dieser Proliferations-/Passagierprozess
wurde viermal ausgeführt.
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BEISPIEL 3: Herstellung
von klonal abgeleiteten MNSC-Nachkommen
-
Die
Zellen von Neurosphären,
die aus adultem strialen ROSA-Gewebe mit Hilfe der in den Beispielen 1
und 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wurden auf etwa 1
Zelle pro Vertiefung in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen
(200 μl
Wachstumsmedium/Vertiefung) verdünnt,
um klonal abgeleitete MNSC-Nachkommen
zu erzeugen. Das Vorhandensein einer einzigen Zelle in einer Vertiefung
wurde mit Phasenkontrastmikroskopie bestätigt. Einzelne Neurosphären entwickelten
sich in etwa 20% der Vertiefungen, was anzeigt, dass jede dieser
Vertiefungen eine einzelne MNSC enthielt, die sich stark vermehrte,
um die Neurosphäre
zu bilden. Die Neurosphären
wurden wie in Beispiel 2 beschrieben passagiert. Nach mehreren Passagen
wurden die Neurosphären
etwa vier Tage nach Bildung zur Transplantation gesammelt.
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BEISPIEL 4: Regeneration
des hämatopoetischen
Systems unter Verwendung von MNSCs
-
Es
wurden gleichen Anzahlen an 2,5 bis 3 Monate alten männlichen
und weiblichen adulten Balb/c-Mäusen
(25 b 30 g, Charles River) einer Ganzkörperbestrahlung (850 Rad) unterzogen,
um funktionsfähige
hämatopoetische
Stammzellen stark zu dezimieren. Die Bestrahlungsabläufe folgten
im Wesentlichen den von Tarbel et al., Development 121: 4077–4083 (1987)
und Down et al., Blood 3: 661–669
(1991) beschriebenen Abläufen.
Aufgrund der Häufigkeit
von Magendarm- und Lungentoxizität, über die
in der Literatur im Anschluss auf Einzeldosen von 850 Rad berichtet
wird, wurde eine fraktionierte Dosis von 450 Rad, gefolgt von 400
Rad 4 Stunden später,
verwendet, was dazu führte,
dass die kumulative vom Weichgewebe absorbierte Dosis bei etwa 850
Rad lag. Während
der Bestrahlung wurden die Tiere per Videokameras ständig auf
Bewegung überwacht.
Es wurden mehrere Maßnahmen
getroffen, um sicherzustellen, dass alle Körperregionen gleiche Strahlungsmengen
erhielten: 1) die Mäuse
wurden in einen Lucite-Käfig
mit Abmessungen gegeben, die verhinderten, dass die Tiere übereinander
kletterten (was die erhaltene Dosis verändern könnte), 2) jeder Teil der Gesamtdosis
wurde mit der Kobaltquelle zuerst an einer dorsalen, dann einer
ventralen Position verabreicht und 3) es wurden Kalibrierungsdetektionsvorrichtungen
an der Oberseite, am Boden und an den Wänden des Behälters sowie
an dem dorsalen Aspekt eines Tiers und dem ventralen Aspekt eines
zweiten Tiers jeder Gruppe aufgeklebt, um die von jeder Tiergruppe
aufgenommene präzise
Dosis genau zu messen. In jedem Fall ermittelten die eingesetzten
Kalibrierungsvorrichtungen, dass die von den verschiedenen Tiergruppen
aufgenommene tatsächliche
Dosis bei 850 Rad ±2%
lag.
-
Mehrere
Chargen angereicherter MNSC-Populationen, die wie in Beispiel 2
und 3 hergestellt wurden, wurden bei Raumtemperatur in EBSS (Earle's Mineralsalzmedium)
resuspendiert. Die Zellen wurden dann bis kurz vor der Transplantation
bei 4°C
gehalten, woraufhin sie auf Körpertemperatur
erwärmt
wurden, um einen Temperaturschock des Rezipiententiers zu vermeiden.
-
Einem
Teil der bestrahlten Mäuse
(„Rezipientenmäuse") wurde 16 Stunden
nach Beendigung des zweiten Bestrahlungsvorgangs eine angereicherte
Population von MNSCs injiziert, die wie vorstehend in Beispiel 2
oder 3 hergestellt wurden. Die für
die Überwachung
und die Prüfung
der bestrahlten Mäuse
zuständigen Untersucher
erhielten keine Angaben zum Inhalt jeder Zellphiole und auch nicht
zu den Rezipienten- und Kontrolltieren. Den Rezipientenmäusen wurde
(mittels Schwanzveneninjektion) 0,2 ml einer angereicherten MNSC-Population
in warmem EBSS (Körpertemperatur)
verabreicht. Die Kontrollmäuse
erhielten nur warmes EBSS bzw. murine Fibroblasten (etwa 106 3T3-Zellen). Als positive Kontrolle erhielten
einige der Rezipientenmäuse
eine Injektion frisch gewonnener ROSA-Knochenmarkzellen (etwa 27.000.000 Zellen).
-
Vor
der Transplantation wurden einige der MNSC-Chargen Cytokinen ausgesetzt.
Die Cytokin-Behandlung bestand aus: Stammzellfaktor (10 ng/ml),
Interleukin (IL) – lalpha
(2 ng/ml), IL-2 (10 ng/ml), IL-3 (5 ng/ml) und IL-6 (10 ng/ml).
Diese Vorbehandlung wurde den Zellen 24 Stunden, bevor die Zellen
in das Rezipiententier injiziert wurden, verabreicht.
-
Da
Anfälligkeit
gegenüber
infektiösen
Agenzien ein Problem im Anschluss an eine Belastung durch letale
Ganzkörperbestrahlung
ist, wurden mehrere Maßnahmen
ergriffen, um dies anzugehen. Die Tiere erhielten erstmals 48 Stunden
vor der Bestrahlung Antibiotika (Neomycinsulfat, 1 mg/ml, dem Wasser
zugesetzt) und ihr Trinkwasser wurde angesäuert (pH 3,5 bis 4,0), um die
bakterielle Flora im Darm zu reduzieren. Die Mäuse wurden in Filterkäfigen in
Räumen
untergebracht, die zur sicheren Unterbringung von immunschwachen
Tieren ausgelegt waren, und wurden mit sterilisierter Nahrung und
sterilisiertem Wasser versorgt. Schließlich trug das Laborpersonal
bei der Arbeit mit den Tieren Mäntel,
Handschuhe, Kopfbekleidung und Masken.
-
Die
bestrahlten Tiere wurden täglich
beobachtet, wobei Körpergewicht,
Fellzustand, Aussehen der Augen, Beweglichkeit und allgemeine Körperhaltung überwacht
und jeden zweiten Tag aufgezeichnet wurden, um den physiologischen
Zustand zu verfolgen. Tiere, die Appetitverlust, verminderte Beweglichkeit,
Durchfall und starken Gewichtsverlust aufwiesen, wurden durch zervikale
Dislokation euthanisiert, und ihr Blut und ihre Organe wurden durch
die nachstehend beschriebene immunhistochemische und fluoreszenzaktivierte
Zellsortierungsanalyse (FACS) auf hämatopoetische Zelltypen und
Transplantationsakzeptanz (wo zutreffend) untersucht. Alle Tiere,
die vorzeitig verstarben, wurden obduziert, um die Todesursache
zu ermitteln.
-
Ergebnisse:
-
Tabelle
I zeigt die Ergebnisse der Anzahl an Tieren, die jede Behandlung überlebten.
-
-
Die
Mehrzahl der MNSC-Nachkommen und Knochenmark-Rezipiententiere überlebten
die Behandlung (mehr als 6 Monate), während die Mehrzahl der Negativkontrolltiere
(die nach der Bestrahlung Fibroblasten, Kochsalzlösung oder
keine Injektion erhielten) nicht länger als 30 Tage überlebten.
An Negativkontrolltieren durchgeführte Autopsien deckten für gewöhnlich kleine
und gelegentlich fehlende Milzen und/oder Thymusdrüsen auf,
was auf ein stark beeinträchtigtes
hämatopoetisches
System hinweist. Im Einklang mit diesem Zustand stand das Vorhandensein
kleiner, graufarbener Lebern bei den Kontrollmäusen mit den längsten Überlebenszeiten,
was einen signifikanten Verlust an roten Blutkörperchen nahe legt. Im starken
Kontrast dazu schienen die überlebenden
MNSC-Rezipientenmäuse über einen
längeren
Beobachtungszeitraum (bis zu 15 Monate) gesund und aktiv zu sein.
-
Zum
Testen auf Transplantationsakzeptanz von Spenderzellen wurde peripheres
Blut der Überlebenden
7 bis 11 Monate nach der Transplantation gesammelt und einer Durchflusszytometrie-FACS-Analyse
unterzogen, und es wurde eine PCR-Amplifikation des Lac Z Gens festgestellt. β-Galaktosidase
wurde in einer Reihe von hämatopoetischen
Zelltypen festgestellt, was nahe legt, dass die vollständige Rekonstitution
aller wesentlichen hämatolymphatischen
Linien eingetreten war.
-
Durchflusszytometrie-Analyse
-
7
bis 11 Monate nach Beendigung des Schwanzvenen-Injektionsvorgangs
(wobei die Studie noch unter Verwendung eines „Doppelblind"-Formats lief), wurde
von den repräsentativen
Mäusen
jedes Zustands peripheres Blut geerntet und auf das Vorhandensein
von β-Gal-Aktivität und hämatopoetischer
Oberflächenantigenexpression
hin untersucht (Berger et al. J. Cytometry, 17: 216–223 (1994).
Zur Erleichterung der Detektion von β-gal+ hämatopoetischen Zelltypen wurde
der FluoroReporter lac-Z-Durchflusszytometrie-Kit (Molecular Probes
Nr. F-1931) eingesetzt.
Im Grunde wurden lebensfähige
hämatopoetische
Zellen mittels hypotonischen Schocks mit einer fluorogenen Beta-Galaktosidasesubstrat-Fluorescein-di-beta-D-Galactopyranosidase (FDG)
beladen. Nicht fluoreszente FDG wird durch β-Galactosidase sequentiell hydrolisiert,
um ein hoch fluoreszentes Fluorescein zu erzeugen, das durch die
Durchflusszytometrieanalyse mühelos
festgestellt werden kann. Aufgrund der hypotonischen Beladung von
FDG bleiben die Zellenoberflächenantigene
intakt und der Propidiumiodidauschluss zum Testen auf Lebensfähigkeit
kann immer noch verwendet werden. Dieses Vorgehen zeigte das Vorhandensein
von β-gal-positiven
Zellen im peripheren Blut von Rezipientenmäusen an. Das so genannte Backgating
der β-gal-positiven
Zellen in Mäusen,
die mit ROSA-Knochenmark oder MNSC-Nachkommen wiederbevölkert wurden,
zeigte ein ähnliches
Verteilungsmuster, was nahe legt, dass in beiden Tieren ähnliche
Zelltypen erzeugt wurden.
-
Neben
dem lacZ-Gen exprimieren ROSA-96-Zellen ein MHC-Typ-1-Molekül (in der
Maus als H-2-Typ bezeichnet), das sich von den Balb/c-Wirten unterscheidet
(H-2Kb bzw. H-2Kd).
Daher war es möglich,
das Vorhandensein und den sich ergebenden Phänotyp von MNSC-Nachkommen in
transplantierten Tieren mit Hilfe von Immunocytochemie zu überwachen.
Um eine Transplantationsakzeptanz zu detektieren, wurden verschiedene
hämatopoetische
Gewebe (einschließlich
Blut) von transplantierten Tieren und von Kontrolltieren für Durchflusszytometrie
mit Hilfe von H-2Kd- und N-2Kb-Antikörpern bearbeitet,
um verschiedene H-2-Isotypen zu detektieren. Die verwendeten Antikörper waren
CD4 (Nr. 09005A), CD11b (01715B), CD19 (O9655B) und H-2Kb (06105A), alle als Phycoerythrin(PE)-Konjugate,
biotinylierte H-2Kb (06102D) und H-2Kd (06092D) sowie Mäuse-IgG1a,
K (Isotypkontrolle), alle von Pharmingen (San Diego, CA). Alle primären Antikörper wurden
bei 1:50 verwendet.
-
Streptavidin-FITC-Konjugat
(Jackson Laboratories; Mississauga, ON) wurde bei einer Verdünnung von
1:100 verwendet. Alle zu Erzeugen von Daten verwendeten Tiere hatten
mindestens 6 Monate lang nach Bestrahlung überlebt.
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Es
wurden Zellsuspensionen aus Milz und Thymus in EBSS durch Schneiden
des Organs in kleine Stücke,
dann Mahlen zwischen zwei mattierten Corning-Objektträgern erzeugt. Knochenmark wurde
aus den Oberschenkelknochen mit EBSS gespült. Erythrozyten wurden in
144 mM NH4Cl, 17 mM Tris-Cl, pH 7,2 vier Minuten
lang bei Raumtemperatur lysiert. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer
(EBSS+ 1,0% fötales
Kalbsserum) gespült,
bei 1.100 U/min. 7 Minuten lang zentrifugiert und vor dem Zählen in
FACS-Puffer resuspendiert. Für
das Antikörperfärben wurden
50 μl Antikörperlösung mit
50 μl Zellsuspension
(1,0 × 106 Zellen) gemischt und 30 Minuten lang bei
4°C inkubiert.
Die Zellen wurden in FACS-Puffer
gespült,
bei 1.100 U/min. 5 Minuten lang zentrifugiert, in 50 μl FAS-Puffer
resuspendiert und mit 50 μl
eines sekundären
Antikörpers
(falls zutreffend) 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Schließlich wurden
die Zellen in FACS-Puffer gespült,
zentrifugiert und zur Durchflusszytometrieanalyse in 500 μl EBSS resuspendiert.
Es wurden Isotypkontrollen verwendet, um „Gates" zu setzen, wenn biotinylierte Antikörper eingesetzt
wurden. Bei den direkt markierten Antikörpern wurden Gates nur mit
Zellen gesetzt. Unmittelbar vor der Durchflusszytometrieanalyse
wurde den Kontrollsuspensionen Propidiumiodid zugegeben, um eine
Lebensfähigkeit
von > 95% sicherzustellen.
Die Durchflusszytometrieanalyse wurde auf einem FACScan (Becton-Dickinson)
durchgeführt,
wobei alle Vorgänge
an der Vorwärts /Seitenstreuung
gegated wurden, um die Anzahl an H-2Kb+ Zellen
zur Gesamtzahl an Gate-Vorfällen
(n = 6, ± S.
E. M.; p < 0,05)
zu quantifizieren. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle
II gezeigt.
-
-
Es
wurden Dot-Blots von H-2Kb- kontra H2kd-positiven Zellen in peripherem Blut und
H-2Kb-markierten CD4-(T-Zellen), CD19-(B-Zellen)
oder CD11b-(Granulozyten) positiven hämatopoetischen Zelltypen in
Milzzellensuspensionen von nicht bestrahlen Kontrolltieren (ROSA26,
Balb/c) und bestrahlten Rezipiententieren erzeugt. Die H-2Kb-positiven Zellen wurden in der Milz und
in dem peripheren Blut von Tieren festgestellt, die entweder ROSA-Knochenmark
oder MNSC-Nachkommen erhalten hatten. Keine H-2Kb-positiven
Zellen wurden in Tieren gefunden, denen nur EBSS injiziert worden
war. Bei Rezipienten von neuralen und hämatopoetischen Stammzellen
wurden H-2Kb-positive Zellen auch in anderen
hämatopoetischen
Geweben gefunden, einschließlich
Knochenmark und Thymus. Die Populationen jedes der differenzierten
Phänotypen
(die alle der terminal differenzierten hämatopoetischen Zelltypen mit
Ausnahme von Erythrozyten darstellen) erwiesen sich in der Milz
von hämatopoetischen
und MNSC-Rezipienten als doppelmarkiert mit dem H-2Kb-Antigen.
-
Eine
weitere immunocytochemische Analyse von H2Kb-positiven
Zellen in MNSC-Nachkommenrezipienten
zeigte das Vorhandensein von T-Linienzellen (H-2Kb+/CD81; H-2Kb+/Cd3e+), B-Linienzellen (H-2Kb+/B220+; H-2Kb+/IgM+; H-2Kb/IgD), Granulozytenlinienzellen
(H-2Kb+/CD89+) und
Myeloidlinienzellen (H-2Kb+/Mac-3+) auf, was belegte, dass MNSC-Nachkommen
alle wichtigen hämatopoetischen
Zelllinien erzeugten.
-
Tabelle
III zeigt den Prozentsatz der ROSA26-Zellen (H-2Kb+)
in den Milzen von transplantierten Tieren und Kontrolltieren, die
auf die hämatopoetischen
spezifischen Antigene CD3e (T-Zellen), CD11b (Granulozyten) und
CD 19 (B-Zellen) doppelmarkiert waren, und zwar 7 bis 11 Monate
nach Transplantation durch Durchflusszytometrie getestet. Eine signifikante
Anzahl an doppelmarkierten Zellen fand sich in Tieren, denen ROSA26-Knochenmark,
embryonale neurale Stammzellen (NSCs) und klonal abgeleitete adulte
NSCs injiziert worden waren. Alle Prozentsätze werden zur Gesamtzahl der
Gate-Vorfälle
berechnet (n = 6, ± S.
E. M.; p < 0,05).
-
-
Um
die durchflusszytometrischen Ergebnisse weiter zu bestätigen, wurden
die gleichen Proben mit einer Cytospin auf Deckgläser zentrifugiert
und mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Um dies zu verwirklichen,
wurden Zellen, die zuerst für
die durchflusszytometrische Analyse (siehe oben) erzeugt wurden, mit
Hilfe von 4% Paraformaldehyd/0,1% Gluteraldehyd in einem Verhältnis von
1:1 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Dann wurden die
Zellen auf Deckgläser,
die mit 10% Rattenalbumin (Gibco BRL) vorbeschichtet worden waren,
mit einer Cytospin bei 700 U/min. 8 Minuten lang bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Die Deckgläser
wurden mit Hilfe von Fluorosave (Calbiochem, La Jolla, CA) montiert
und unter Verwendung eines Zeiss Axioscop Fluoreszenzmikroskops
visualisiert.
-
Die
Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Alle differenzierten
hämatopoetischen
Linien wurden in bestrahlen Tieren beobachtet, die EBSS erhielten,
doch keine der Zellen exprimierte das H-2Kb-Antigen.
Bei Tieren, die aus ROSA-26 gewonnenes Knochenmark erhielten, wurden
alle differenzierten Phänotypen
beobachtet, wobei ein erheblicher Anteil dieser Zellen H-2Kb exprimierte. Ein ähnliches Ergebnis wurde in
Tieren beobachtet, die MNSC-Nachkommen erhielten, was belegt, dass
eine MNSC-Transplantation eine Knochenmarktransplantation ersetzen
kann. Mit H-2Kb und entweder CD4, CDIIb
oder CD19 doppelmarkierte Zellen wurden in Tieren visualisiert,
die MNSC-Nachkommen erhielten, die gemäß den Beispielen 2 und 3 erzeugt
worden waren.
-
Zur
qualitativen Identifizierung der Transplantationsakzeptanz von neuralen
Stammzellen in früheren hämatopoetischen
Linien wurde das Knochenmark von MNSC- und Knochenmark-transplantierten
Tieren zur Verwendung in klonogenen In-vitro-Assays isoliert. Die aus dem Knochenmark
isolierten Zellen wurden auf eine Dichte von 500 Zellen/mL in IMDM
verdünnt,
supplementiert mit 2% HIFBS (Gibco BRL). Die Zellen wurden laut
Herstelleranweisungen MethoCult (Stem Cell Technologies Inc) zugegeben,
wurden mit den entsprechenden Cytokinen supplementiert, in einem
1/10 v/v Verhältnis,
und es wurden 1,1 mL in 35 mm Schalen gegeben und 10–14 Tage
bei 37°C
in einer 5% CO2-Atmosphäre belassen. Die benutzten
Cytokine waren: Interleukin-3 (10 ng/mL), Interleukin-7 (10 ng/mL),
Stammzellenfaktor (50 ng/mL), Erythropoietin (3 U/mL) (R & D Systems) und Interleukin-6
(10 ng/mL; Novartis). X-Gal-Histochemie wurde verwendet, um β-Galactosidase-Aktivität in Klonen
neuralen Stammzellenursprungs zu detektieren. 10–14 Tage nach dem Plattieren
wurde Methylcellulose-Kulturen eine X-Gal-Arbeitslösung bestehend aus 5 mM K3F3(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)63H1O, 2 mM MgCl2 (Sigma)
und X-gal (in Dimethylsulfoxid; Molecular Probes) zu einer Endkonzentration
von 1 mg/mL in PBS (pH 7,4) zugegeben. Die Kulturen wurden 8 Stunden
lang bei 37°C
400 μl X-Gal-Arbeitslösung ausgesetzt.
Mit Hilfe eines Kodak Ektachrom-400-Diafilms unter Verwendung einer Canon
Epoh Kamera, die auf einem inversem Zeiss Axiophot Mikroskop montiert
wurde, wurden Fotos gemacht. Unter Kontrollbedingungen verfärbte sich
keine der aus Balb/c-Knochenmark gewonnenen Kolonien blau, während die
Mehrzahl der ROSA26-Klone dies tat. Aus Tieren, die entweder embryonale
oder adulte Stammzellen erhalten hatten, isoliertes Knochenmark
ließ Kolonien
von Zellen entstehen, die sich bei Exposition mit X-gal blau verfärbten (2A–2D),
was nahe legt, dass neurale Stammzellen sowohl frühe als auch
späte hämatopoetische Zellen
entstehen lassen können.
Es gab eine Reihe von Klonen, die aus Tieren isoliert wurden, die
entweder adulte oder embryonale neurale Stammzellen erhalten hatte,
und die sich bei Exposition mit X-gal nicht blau verfärbten (2E & 2F).
Dies ist wahrscheinlich auf das Vorhandensein endogener Knochenmarkzellen zurückzuführen, die
nicht in Folge der Bestrahlung eliminiert worden waren. Die Identitäten dieser
Klone schienen ein breites Spektrum früher Zellen zu umfassen.
-
Eine
in Verbindung mit Immunocytochemie durchgeführte FDG-β-Gal-Detektion zeigte das Vorhandensein
von T-Linienzellen (β-gal+ CD4+; β-gal+ CD8a+; β-gal+ CD3e+), B-Linienzellen
(β-gal+ B220+; β-gal+ IgM+; β-gal+ IgD+), Granulozytenlinienzellen
(β-gal+ CD89+) und Myeloidlinienzellen
(β-gal+ Mac-1+), was beweist,
dass MNSC alle wichtigen hämatopoetischen
Linien erzeugten.
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Zur
Identifizierung möglicher
Transplantationsakzeptanz durch neurale Stammzellen, wurde das Vorhandensein
oder Fehlen von lacZ in DNA, die aus den Milzen von 7 bis 12 Monate
vorher transplantierten Tieren isoliert wurde, mit Hilfe von PCR
geprüft.
Das vorbeschriebene sogenannte Primer-Dropping-Verfahren (H. Wong,
W. D. Anderson, T. Cheng K. T. Riabowol, Anal Biochem. 223, 251
(1994)) wurde zum Amplifizieren genomischer DNA mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
benutzt.
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Kurz
gesagt wurden 10 μg
genomischer DNA über
Nacht mit Hilfe von EcoRi verdaut, und es wurden 0,5 μg als PCR-Schablone
verwendet. Es wurden 40 Zyklen zu 94°C (1 Minute), 60°C (1 Minute)
und 72°C
(1 Minute) verwendet, um lacZ mit Hilfe des folgenden Primer-Paars
zu amplifizieren: 5'-TTG
GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA und 3'-TCA ACC ACC GCA CGTA TAG AGA TTC. Nach
20 Zyklen wurden als interne Kontrolle für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
spezifische Primer (GAPDH, 5'-CGG
AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT und 3'AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC) zugegeben.
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In
den Tieren, die Träger-EBSS
erhielten, wurde kein LacZ festgestellt: Zum Vergleich: Tiere, die ROSA26-Knochenmark
erhielten, erzeugten ein sehr starkes Signal. LacZ wurde auch in
Tieren festgestellt, denen ROSA-MNSC-Nachkommen transplantiert wurden.
Dies schien unabhängig
von der Zellenquelle zu sein, da Tiere, denen entweder embryonale
oder adulte (einschließlich
klonal abgeleitete adulte) neurale Stammzellennachkommen injiziert
wurden, ein starkes Signal erzeugten. Zum Ausschluss der Möglichkeit
eines falschen negativen Ergebnisses wurde das gencodierende GAPDH
mit lacZ im gleichen Reaktionsglas gemeinsam amplifiziert. Das Vorhandensein
eines schwach amplifizierten GAPDH-Signals unter allen Bedingungen
zeigte an, dass die lacZ-Amplifzierung echt war.
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Eine
weitere Analyse umfasste die Southern-Blot-Analyse, die Umkehrtranskription-Polymerasekettenreaktion
(RT-PCR) und genomische PCR der geernteten Gewebe, um β-gal+ Zellen in dem peripheren Blut zu identifizieren.
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BEISPIEL 5: Fähigkeit
von MNSCs, das hämatopoetische
System zu erhalten
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Die
Fähigkeit
der MNSCs, neue hämatopoetische
Stammzellen zu erzeugen, wird durch Entnahme von Knochenmark aus
den überlebenden,
bestrahlten Tieren von Beispiel 4, die markierte Zellen neuralen
Ursprungs erhalten hatten, und Injizieren der erzeugten Knochenmarkzellen
in bestrahlte Rezipiententiere, bei denen die endogenen hämatopoetischen
Stammzellen stark dezimiert oder zerstört wurden, ermittelt. Die Genesung
der bestrahlten Tiere und das Vorhandensein markierter Zellen im
Knochenmark der Rezipienten zeigen an, dass das Knochenmarktransplantat
lebensfähige
hämatopoetische
Stammzellen enthielt, die ursprünglich
aus neuralem Gewebe abgeleitet wurden.
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BEISPIEL 6: Behandlung
von Immunschwäche
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Mäuse, die
eine Keimlinienmutation in einem Rekombination aktivierenden Gen
(RAG-1) tragen, weisen eine völlige
Unfähigkeit
auf, reife B- oder T-Lymphozyten zu erzeugen (Mombaerts et al.,
Cell 68: 869–877 (1992).
Das Immunsystem dieser mutierten Mäuse kann als das von nicht
durchlässigen
SCID-Mäusen (schwere
kombinierte Immunschwäche)
beschrieben werden. RAG-1-Zuchtmaterial (Stamm C57BL/6J-Rag1bn1Mom) ist von Jackson Laboratories (Nr.
JR2216) erhältlich.
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MNSC-Nachkommen
wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben mit Hilfe von neuralem
Gewebe, das von RAG-1-Mäusen
und von Hintergrundstamm-C57BL/6J-Mäusen
(Jackson Nr. 664), die nicht die RAG-1-Mutation haben, erhalten
wurde, erzeugt. Mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren
wurden etwa 1.000.000 C57BL/6J-Vorläuferzellen intravenös in die
vorgewärmte
Schwanzvene der RAG-1-Jungen
vor dem Erreichen eines Alters von 3 Wochen injiziert. Ab 4–6 Wochen
nach Injektion wurde von den Rezipiententieren Blut geerntet und
auf die Detektion von Serum CD3e (T-Zellenrezeptor) geprüft; Mombaerts
et al., oben. Das Vorhandensein von CD3e zeigt das Vorhandensein
reifer T-Lymphozyten an, welche Zellen sind, die sich normalerweise
nicht in RAG-1-Mäusen
finden. Ferner kann auch das Vorhandensein von IgM und IgD, die
das Vorhandensein reifer B-Lymphozyten anzeigen, die ebenfalls normalerweise
nicht in RAG-1-Mäusen gefundene
Zellen sind, geprüft
werden; Mombaerts et al., oben. Eine Subpopulation der Tiere, die
auf diese reifen Zelltypen positiv testen, wurde zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Injektion getötet und auf Nachweis von Hämatopoese
geprüft.
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Ergebnisse:
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Bei
Testen mit Hilfe der FACS-Analyse zeigte das Blut von experimentellen
RAG-1-Tieren, die C57BL/6J-MNSC
erhalten hatten, positive Ergebnisse bezüglich CD3e, einem Marker für den T-Zellenrezeptor,
der sich auf funktionsfähigen
T-Zellen findet. Das Blut der Mäuse
dagegen, die entweder RAG-1 oder EBSS erhalten hatten, wies negative
Ergebnisse bezüglich
des CD3e-Markers auf. Dies demonstriert, dass die MNSC-Transplantation
zur Behandlung genetischer Defekte des hämatopoetischen Systems verwendet
werden kann.
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BEISPIEL 7: Allogene Transplantation
zur Behandlung genetischer Defekte
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Es
wurden gesunde MNSC-Nachkommen aus normalem neuralen Gewebe erzeugt,
das aus einer Biopsie eines menschlichen Spenders erhalten wurde,
und wurden in vitro mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren
stark vermehrt, um eine angereicherte Bevölkerung menschlicher multipotenter
neuraler Stammzellen zu erhalten. Die MNSC-Nachkommen werden in
einen einwilligenden Patienten mit einer genetischen Erkrankung
des hämatopoetischen
Systems, beispielsweise – aber
nicht einschränkend – Sichelzellenanämie, transplantiert.
Dem Patienten werden die MNSC nach Erhalt einer Chemotherapie oder
Strahlentherapie zur Dezimierung der hämatopoetischen Stammzellenpopulation
des Patienten verabreicht. Die Zellen werden intravenös über einen
Zeitraum von 24–48
Stunden bei einer Dosis von 1 × 102 bis 5 × 106 Zellen/kg verabreicht. Der optimale zeitliche
Verlauf der Verabreichung und die Anzahl der zu verabreichenden
Zellen müssen
eventuell in einigen Fällen über dieser
Zahlenangabe liegend modifiziert werden. Die MNSCs werden 36–48 Stunden
nach der letzten Dosis Chemotherapie oder Strahlentherapie verabreicht.
Ausgewählte
Wachstumsfaktoren und/oder Cytokine, die bekanntlich Hämatopoese
fördern
(GF-CSF oder G-CSF bei einer Dosis von 250 μg/m2/Tag)
können
nach der Infusion verabreicht werden, bis eine erfolgreiche Transplantationsakzeptanz feststeht.
Eine erfolgreiche Transplantationsakzeptanz gilt als eingetreten,
wenn die Neutrophilenzahl des Patienten an zwei Folgetagen über 0,5 × 109 und 0,5×109 Zellen/L
liegt und wenn die Blutplättchenzahl
des Patienten an 7 Folgetagen über
20 × 109/L liegt. Prophylaktische Antibiotika werden
gegeben, wenn die absolute Neutrophilenzahl unter 0,5 × 109 Zellen/L (orales Ciprofloxain (500 mg zweimal
pro Tag) oder orales Penicillin VK (250 mg alle 6 Stunden) oder
intravenöses
Acyclovir (5 mg/kg alle 8 Stunden) liegt.
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Abhängig von
der Fähigkeit,
Wirts- und Spendergewebe abzustimmen, können Immunsuppressionsmedikamente
verabreicht werden, um Abstoßungsreaktionen
zu verhindern.
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BEISPIEL 8: Autologe Transplantation
zur Behandlung genetischer Defekte
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MNSC-Nachkommen
werden aus neuralem Gewebe erzeugt, das aus einer Biopsie eines
Patienten erhalten wurde, der an einer genetischen Erkrankung leidet,
die die Blutzellen betrifft. Die MNSCs des Patienten werden in vitro
mit Hilfe der in dem U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Verfahren
stark vermehrt, um eine angereicherte Population multipotenter neuraler
Stammzellen zu erhalten. Die MNSC-Nachkommen werden mit Hilfe bekannter
Verfahren genetisch modifiziert, um den genetischen Defekt zu beheben.
U.S. Pat. Nr. 5,760,012 beschreibt zum Beispiel Verfahren zur genetischen
Modifizierung von hämtopoetischen
Stammzellen bei Patienten, die unter Hämoglobinopathien wie Sichelzellenanämie, Beta-Thalassämie oder
Gaucher-Krankheit
leiden. Verfahren zur Behandlung von Sichelzellenanämie werden
von Cole-Strauss, A., et al. (Science, 273: 1386–1389 (1996)) beschrieben.
Die gleichen Verfahren können
zum genetischen Modifizieren von MNSCs eines Patienten verwendet
werden.
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Die
genetisch modifizierten MNSC-Nachkommen werden dem Patienten transplantiert.
In einigen Fällen
kann es wünschenswert
sein, zuerst den Patienten mit Chemotherapie oder Strahlentherapie
zu behandeln, um die erkrankte hämatopoetische
Stammzellenpopulation des Patienten zu dezimieren. Die genetisch modifizierten
MNSCs werden mit Hilfe der vorstehend in Beispiel 8 beschriebenen
Verfahren intravenös
verabreicht.
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BEISPIEL 9: Allogene Transplantation
zur Verleihung von HIV-Resistenz
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Es
werden MNSC-Nachkommen aus dem aus einer Biopsie eines menschlichen
Spenders erhaltenen neuralen Gewebes erzeugt, die die CCR5-Allele
aufweisen, die nachweislich Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion verleiht
(Samson et al., oben) und in vitro mit Hilfe von auf dem Gebiet
bekannten Verfahren stark vermehrt, um eine angereicherte Population
menschlicher multipotenter neuraler Stammzellen zu erhalten. Mit Hilfe
der in Beispiel 7 beschriebenen Vorgehen werden die MNSC-Nachkommen einem
HIV-infizierten Patienten transplantiert, um ein Fortschreiten von
AIDS zu verhindern oder zu beschränken. Alternativ können die MNSC- Nachkommen einem
nicht infizierten Patienten transplantiert werden, um Immunität oder Resistenz
gegenüber
einer HIV-Infektion zu verleihen.
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BEISPIEL 10: Autologe
Transplantation zur Verleihung von HIV-Resistenz
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Von
einem HIV-infizierten Patienten wird neurales Gewebe gewonnen. Unter
Verwendung der in U.S. Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehensweisen
werden in dem neuralen Gewebe vorhandene MNSCs in vitro stark vermehrt.
Die MNSC-Nachkommen
werden mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren genetisch
modifiziert, um das endogene CCRS-Gen durch eine CCR5-Allele zu
ersetzen, die nachweislich Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion verleiht
(Samson et al., oben) Die genetisch modifizierten MNSC-Nachkommen
werden dem Patienten mit Hilfe der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren
transplantiert.
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BEISPIEL 11: Autologe
Transplantation bei Chemotherapiepatienten
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Bevor
ein Patient einer hochdosierten Chemotherapie unterzogen wird, wird
eine neurale Gewebebiopsie des Patienten durchgeführt und
die MNSCs werden in vitro vermehrt und mit Hilfe der in U.S. Pat.
Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehensweisen gelagert. Die Zellen
werden dem Patienten nach der Chemotherapiebehandlung mit Hilfe
der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren infundiert. Immunsuppressionsmedikamente
sollten nicht erforderlich sein.
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BEISPIEL 12: Xenoinkubation
von MNSCs zur Erzeugung hämatopoetischer
Zellen zur Reinfusion in Spenderspezien
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Menschliche
embryonale MNSCs, die aus dem Zwischenhirn eines Fötus oder
Erwachsenen erhalten werden, werden in vitro mit Hilfe der in U.S.
Pat. Nr. 5,750,376 beschriebenen Vorgehensweisen vermehrt. Nach
mehreren Passagen werden Zellen aus 1 Woche alten Neurosphären erhalten.
Es werden etwa 1 × 106 Zellen in die Schwanzvenen bestrahlter
RAG-1-Mäuse
injiziert, wie in Beispiel 4 dargestellt wird.
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Man
lässt die
Tiere überleben,
und in regelmäßigen Abständen wird
Blut geerntet, um zu beweisen, dass menschliche MNSC das hämatopoetische
System von Mäusen
wiederbevölkern
können.
Die Fähigkeit der
menschlichen neuralen Stammzellen, das hämatopoetische System von Mäusen wiederherzustellen, zeigt,
dass MNSCs in andere Spezien von Säugern injiziert werden können, insbesondere
in größere Tiere
wie Schweine und Pferde, bei denen die MNSCs die Herstellung von
neuen menschlichen Blutzellen dirigieren, die zur Verwendung in
menschlichen Patienten geerntet werden können.