WO2006085587A1 - ニューロスフェア形成剤 - Google Patents

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WO2006085587A1
WO2006085587A1 PCT/JP2006/302259 JP2006302259W WO2006085587A1 WO 2006085587 A1 WO2006085587 A1 WO 2006085587A1 JP 2006302259 W JP2006302259 W JP 2006302259W WO 2006085587 A1 WO2006085587 A1 WO 2006085587A1
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WO
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cells
rod
positive
notchl
mouse
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PCT/JP2006/302259
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masahiro Toda
Shigeki Ohta
Masae Yaguchi
Hideyuki Okano
Original Assignee
Keio University
Institute Of Gene And Brain Science
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Publication date
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14Blood; Artificial blood
    • A61K35/15Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a neurosphere-forming agent containing mature and Z- or Notch-positive rod cells and a pharmaceutical composition for improving nerve function caused by nerve damage.
  • rod-shaped cells are classified into several subtypes in mouse and human depending on the expression of surface markers and biological functions (Liu, YJ, Cell vol.106, p.259-62). , 2001). However, it was not clear how the subtypes of rod cells are related to the motor function improving effect.
  • the present invention provides a neurosphere-forming agent that forms eurospheres with high efficiency by clarifying the subtypes of rod cells and their respective -eurosphere-forming ability or ability to improve nerve function.
  • the present invention was made for the purpose of providing a pharmaceutical composition that efficiently improves the nerve function in which a disorder has occurred.
  • CD83-positive cells expressed Notchl at a high level, and are a marker of mast cell immaturity in humans. It was found that the expression of certain CDla was reduced. This is because in mice, This supports the result of increased Notchl expression in dendritic cells.
  • the eurosphere-forming agent that works for the present invention contains mouse CD8a-positive rod-shaped cells as an active ingredient.
  • the eurosphere-forming agent useful in the present invention may contain mature rod-shaped cells or Notch-positive rod-shaped cells as active ingredients.
  • the above-mentioned rod-shaped cells may be derived from a mouse or a human, but the origin is not limited to these.
  • the mouse CD8a-positive rod cells and the mature rod-shaped cells may be Notch-positive.
  • the pharmaceutical composition for improving nerve function caused by nerve damage according to the present invention contains mouse CD8a-positive rod cells as an active ingredient.
  • the nerve function may be a motor function.
  • the nerve injury may be spinal cord injury.
  • the pharmaceutical composition may include mature rod cells! Or Notch-positive rod cells as active ingredients. Any of the aforementioned rod-shaped cells may be derived from a mouse or a human, but the origin is not limited to these.
  • the mouse CD8 ⁇ -positive rod cells and the mature rod cells may be Notch-positive.
  • the marker of the rod-shaped subtype that is useful in the present invention is a Notch gene-related substance.
  • the gene-related substance can be any gene and any substance that can be transcribed and translated. For example, genomic DNA encoding a gene, cDNA, their complementary strand, transcript mRNA, translation Polypeptides and proteins that can be produced.
  • Notch is preferably Notchl.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of comparing the neurosphere-forming ability of mouse spinal cord-derived neural stem cells and mouse linear body-derived neural stem cells in the presence of rod-like cells in one example according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the eurosphere-forming ability of CD8a-positive rod cells contained in mouse spleen-derived immature rod cells in one example according to the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of the ability to form eurosphere by mouse CD1 lc-positive mature rod cells in one example according to the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the eurospheroid formation ability of mouse CD8a-positive mature rod cells in one example according to the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the -Eurosphere formation ability of mouse Notch-positive rod-shaped cells in one example that is relevant to the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring -Eurosphere formation ability by human Notch-positive rod cells in one example that is relevant to the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing results of behavioral function recovery experiments in spinal cord injury model mice by transplanting mouse spleen-derived CD11 positive cells and CD8 a positive rod cells in one example according to the present invention.
  • Rareing (A) and BBB score (B) show the results of observation over time
  • Rotarod test (C) shows the analysis results 56 days after surgery.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of examining the proliferation after transplantation of CD8a-positive rod cells in a mouse spinal cord injury model by histological analysis in one example according to the present invention.
  • FIG. 9A is a graph showing the results of FACS analysis of the correlation between the expression of CD8 ⁇ and Notchl in mouse rod cells in one example according to the present invention.
  • FIG. 9B is a diagram showing the results of analysis of the correlation between the expression of CD8 ⁇ and Notchl in mouse rod-shaped cells by RT-PCR in one example that is relevant to the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of behavioral function recovery experiments in spinal cord injury model mice by transplanting mouse spleen-derived Notchl-positive rod cells in one example according to the present invention.
  • Rareing (A) BBB score
  • B) is the result of time-lapse observation
  • slipping test (C) Shows the analysis results at 3 months after surgery.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of FACS analysis of the correlation between the expression of CD83 and Notchl in human rod-like cells in one example that is relevant to the present invention.
  • CD8a cell surface molecule usually expressed on cytotoxic T cells, in mouse rods is used to identify a subset of rods that are anatomically and functionally different. . Within that subset, CD8a-positive rod cells can form eurospheres more efficiently than CD8a-negative cells when co-cultured with neural stem cells.
  • Spider cells can be classified into a subset expressed at a high level (Notchl positive) and a subset expressed at a low level (Notchl negative) according to the expression level of Notchl.
  • CD8a-positive rod cells express Notchl at a higher level than CD8a-negative rod cells, so they were classified by the subset classified by the expression level of Notchl and the expression of CD8a. Subsets are considered to be quite overlapping.
  • mouse CD8a-positive rods In humans, subtypes that correspond exactly to mouse CD8a-positive rods have not been identified, but can be classified by the level of Notchl expression, and rods that express Notchl at high levels It is more efficient than rod-like cells expressing Notchl at a low level-it can form eurosphere.
  • Mouse CD8a-positive rod cells or mature rod cells that highly express Notchl are particularly preferred.
  • Notch signaling has been shown to play an important role in the maturation of rodent cells derived from human monocytes (Weijzen et al "J. Immunol 169, 4273-4278, 2002)
  • Notchl-deficient mice There is no abnormality in mast cell maturation in Notchl-deficient mice (Radtke et al., J. Exp. Med. 191, 1085, 2000), so other Notch molecules are expressed and have redundant functions. Therefore, not only the Notchl but also other members of the Notch-family (for example, Notch2-4) can be used if they are highly expressed in mature rods! / ! /
  • the eurosphere-forming agent that works according to the present invention is capable of forming mouse CD8a-positive rod cells, mature rod cells, Notchl (especially Notchl) that can form eurospheres more efficiently. Highly expressed, containing rod-shaped cells alone or in combination.
  • a neurosphere-forming agent is typically a liquid preparation in which these rod-shaped cells are suspended in a buffer solution or a medium. It is not limited to this.
  • the neurosphere-forming agent may contain various carriers and additives such as collagen, glycerol, DMSO, sugar and preservatives in addition to the rod-shaped cells.
  • the above-mentioned rod-like cells suitable as a eurosphere-forming agent can be contained as an active ingredient in a pharmaceutical composition that improves nerve function caused by nerve damage. That is, the pharmaceutical composition according to the present invention contains mouse CD8a-positive rod cells, mature rod cells, and Notch (especially Notchl) at high expression, and contains such rod cells alone or in combination. . CD8a-positive rods and mature rods that highly express Notch (particularly Notchl) are particularly preferred.
  • the present pharmaceutical composition is typically a liquid preparation in which these rod-shaped cells are suspended in a buffer solution, a medium, or the like. Is not limited to this.
  • the pharmaceutical composition may contain various carriers and additives such as collagen, glycerol, DMSO, sugar, and preservatives.
  • the origin of the rod-shaped cells used in the present invention is not limited as long as they are human and non-human vertebrates. (In this specification, the origin of rod-shaped cells not limited by animal names is not particularly limited.)
  • Spider cells are widely distributed throughout the body, and any tissue force can be adjusted, but it is preferable to adjust from spleen, blood, and bone marrow.
  • the spleen is isolated directly from the spleen, but from the peripheral blood and bone marrow, after differentiation induction into the spleen cell under certain conditions, the spleen cell of each subtype is separated using the subtype marker as an indicator. To do.
  • the separation method is not particularly limited, but a method using an antibody affinity is preferable. For example, using antibodies against CD8a, CD11, CD83, Notchl, etc., cells having each marker can be isolated by a column method or batch method. In addition, cells that express each marker on the cell surface can be separated by FACS using an antibody conjugated with a fluorescent dye.
  • mature rod cells can be efficiently obtained by subjecting the rod cells to maturation before separation.
  • stimulation with OK-432 may be performed on the fifth day of culture, but the method is not particularly limited.
  • the thus isolated rod-shaped cells may be treated so as not to proliferate by mitomycin C treatment, UV treatment, radiation treatment or the like.
  • Neural stem cell culture and eurosphere formation are basically confirmed by Weiss et al. Based on established culture methods (Reynolds et al., Science 255, 1707-10, 1992).
  • cells isolated from the central nervous system tissue can be suspended in a medium containing growth factors (EGF, FGF, etc.) to form neurospheres (nerve cell mass). As the mass grows, it can dissociate again into single cells and be passaged.
  • EGF growth factor
  • the tissue from which the neural stem cells are derived is a central nervous system tissue including neural stem cells (neuroepithelium, neural tube, cerebral cortex, striatum, olfactory bulb, SVZ (subventricular zone, ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 Difficulty) (Hippocampal dentate gyrus), spinal cord, etc.)
  • neural stem cells neuroepithelium, neural tube, cerebral cortex, striatum, olfactory bulb, SVZ (subventricular zone, ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 Difficulty) (Hippocampal dentate gyrus), spinal cord, etc.
  • neurospheres By co-culturing neural stem cells obtained from these tissues with the rod-shaped cells contained in the neurosphere-forming agent, neurospheres can be formed more efficiently.
  • the ratio of the number of cells is preferably 200 neural stem cells: 10 5 rod cells.
  • a pharmaceutical composition containing the isolated rod-shaped cells as an active ingredient can improve the nerve function caused by nerve damage.
  • the nerve damage to be treated is not limited as long as it is a damage to the central nervous system, and may be brain damage or spinal cord damage. Both are differentiated from neural stem cells, and the rod cells can support the proliferation of neural stem cells.
  • a causative disease of such nerve damage cerebrovascular disorder, spinal vascular disorder, brain and spinal cord tumor
  • neuropathy caused by spinal disease infectious disease, dementia disease, metabolism, toxic disease, basal ganglia
  • Degenerative diseases, spinocerebellar degenerative diseases, motor neuron diseases, peripheral neurological diseases, demyelinating diseases, muscle diseases, and congenital abnormalities are considered, such as gait disorder, standing disorder, convulsions, chorea, Balism, dystonia, epilepsy, myoclonus, tic, brain bleeding, cerebral thrombosis, cerebral embolism, cerebral infarction, stroke, cerebral ischemia, Binswanger disease, hemiplegia, limb paralysis, ataxia, spinal cord infarction, spinal vein infarction , Brain tumor, spinal cord tumor, encephalitis, brain abscess, tuberculoma, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, dementia, Wilson's disease, hepatic lens nuclear degeneration, Men kes disease
  • a pharmaceutical composition containing such rod-shaped cells is transplanted to the site of nerve injury.
  • the transplantation method is not particularly limited, and the amount of transplanted cells, the number of transplants, etc., to be followed according to conventional methods are appropriately determined.
  • the striatum and spinal cord of embryonic day 14 mouse embryonic brain were collected and placed in DMEM / F12 medium with EGF (20 ng / ml, Peprotech), FGF2 (10 ng / ml, Peprotech), and insulin (25 ⁇ m).
  • EGF 20 ng / ml, Peprotech
  • FGF2 10 ng / ml, Peprotech
  • insulin 25 ⁇ m.
  • sodium selenate (30 nM, Sigma)
  • putrescine 60 ⁇ M, Sigma
  • This neural stem cell strength lucia was subcultured every 5 days, and the following experiment was performed.
  • Accumax Inovative cell technologies
  • the cells were physically dissociated, washed with DMEM / F12 medium, and then the above.
  • a new plate was seeded at a cell density of 50 cells / z 1 using mouse neural stem cell culture medium.
  • Human neural stem cells used were those obtained by culturing neural stem cell lines established from aborted fetal brain according to the regulations of the Keio University School of Medicine Ethics Committee.
  • Human neural stem cell culture media include hrFGF2 (20 ng / ml, PeproTech), hrEGF (20 ng / ml, Peprotech), hrLIF (10 ng) in DMEM / F12 (1; 1) —bases medium (Invitrogen).
  • a cell strainer 100 ⁇ m, BDFalcon
  • RPMI medium was overlaid in a centrifuge tube, followed by 8500 rotations for 15 minutes Centrifugation was performed to collect the cell fraction in the intermediate layer between the BSA solution and RPMI.
  • the cell fraction was collected using MACS beads (Miltenyi Biotec) according to each mouse rod-shaped cell subtype. That is, using CDl lc (N418) magnetic beads and CD8 a + Dendritic Cell Isolation kit, CDl lc positive rod cells (hereinafter referred to as rod cells) and CD8 a positive rod cells were respectively obtained from the above cell fractions. separated. CD8 a-negative rod cells were collected using the remaining fractionation CDl lc magnetic beads from which CD8 a-positive rod cells were collected (Fukao T "Immunology 164, 64-71, 2000). Known as a marker for rod cells.
  • mouse mature rod cells are to cultivate immature rod cells in R10 medium (RPMI + 10% FCS) for 3 hours, remove floating cells, and further culture overnight in R10 medium. Therefore, the obtained cells were used as mature rod cells.
  • R10 medium RPMI + 10% FCS
  • mice Notchl-positive rod cells from the above cell fraction, PE-conjugated anti-CD1 lc antibody (e-Bioscienses), Usagi anti-Notchl antibody (Santa cruz) and FITC-conjugated anti-usagi After sequentially reacting IgG antibodies (Beckman coulter), FITC-positive Notchl-positive cells were separated using Moflo (Modular Flow, Dako cytometer).
  • Human rod-like cells were isolated from human peripheral blood. Human peripheral blood was overlaid on lymphoprep (Axis-Shield PoC AS), and then centrifuged to collect an intermediate layer containing mononuclear cells. After separating CD14 positive monocytes with CD14 magnetic beads, seed them at 5X10 5 / ml in R10 medium containing hrGM-CSF and hrIL-4 (each 100 ng / ml, Peprotech), 7-8 days Culture was performed to obtain human immature rod cells (Araki H., British J Haematology 114, 681-89, 2001). Human mast cells are matured by stimulating with OK-432 (Chugai, 0.1 KE / ml) on the 5th day of culture of CD14-positive monocytes. Was used to purify mature rods.
  • Mouse embryonic telencephalic striatum-derived and spinal cord-derived neural stem cells were digested with Accumax (Inovative cell technologies) at 37 ° C for 10 minutes to dissociate into single cells, and then Cell Sorter I (Epics Altra, Beckman Coaltal) ), PI (Propidium Iodide) negative single cells with a diameter of around 10 mm were selected, and 200 cells each were added to a low-adhesion 96-well plate (Coaster) filled with neural stem cell medium (clonal density) . Within each well, co-culture with 10 5 C Dl lc positive rods and add rods!
  • the number of neurospheres formed was compared 10 to 14 days after the start of culture. An increase in the ability to form eurospheres was observed (Fig. 1). From this, it was considered that the reactivity to the rod-like cells was the same even if the neural stem cells derived from different tissues of the central nervous system were used. For the experiments using the following mouse experimental system, Body-derived cells were used.
  • Mouse spleen-derived rod cells can be classified into CD8a-positive rod cells and CD8a-negative rod cells using CD8a expression as an index. Therefore, we examined whether these subtypes differed in their ability to form eurospheres. As a result, the pre-fractionation of the rod-shaped cells was about twice as much as that of the control (no rod-shaped cells added)-eurosphere-forming ability, whereas the CD8a-positive rod-shaped cells were 8% of the control. It was clear that it had a remarkably high ability to form eurospheres, about double ( Figure 2). This indicates that the eurosphere-forming agent is useful as a eurosphere-forming agent that contains mouse CD8a-positive rod cells as an effective component.
  • the function of the rod-shaped cells varies depending not only on the subtype but also on the maturity level. I examined it. First, using mouse CDl lc positive rod cells and inducing maturation, and comparing the immature rod cells with the ability to form neurospheres, mature rod cells showed a significantly higher ability to form eurospheres. (Fig. 3). In addition, when using mouse CD8a-positive rod cells to induce maturation and compare their ability to form neurospheres with immature rod cells, mature rod cells are also significantly higher-eurosphere formation (Figure 4). This indicates that the eurosphere-forming agent is effective as an eurosphere-forming agent that contains mature rod-like cells as an active ingredient.
  • Notchl-positive rod-shaped cells showed significantly higher eurosphere-forming ability than the control in both the mouse system (FIG. 5) and the human system (FIG. 6).
  • the rod-shaped cells were irradiated with a dose of 40 Gray and stopped for proliferation before being subjected to a co-culture experiment.
  • a mouse was placed in a plastic box with a black bottom of 60x60cm, and the number of standing movements was examined (Mikami, J Neurosurg 97, 142-147, 2002) 0
  • SCANET Toyo Sangyo Co. Ltd.
  • the mouse was placed in the box for 10 minutes and allowed to move freely, and the movement distance and the standing action by the lower limbs were mechanically measured.
  • BBB score (Basso—Beattie—Bresnahan locomotor rating scale) The score was assigned according to the following criteria (Basso DM, J. Neu rotrauma 12: 1-21, 1995). In order to make the score objective, the group was evaluated blindly and several average points were used.
  • CD8a-positive rod cells showed a higher motor function improvement effect than CDllc-positive rod cells before separation. It became clear to show.
  • This result shows that a pharmaceutical composition containing mouse CD8a-positive rod-shaped cells as an active ingredient is useful for improving the motor function caused by nerve damage.
  • This pharmaceutical composition is thought to be useful for improving not only motor functions but also behavioral functions such as sensory functions, as long as they are functional disorders caused by neurological disorders.
  • [0061] Histological analysis after transplantation of CD8 a-positive rod cells in a mouse spinal cord injury model To analyze the nerve regeneration effect of the rod cells transplanted into the spinal cord injury mouse, Then, the number of newly generated neurons was examined.
  • BrdU 50 mg / Kg
  • CDl lc and CD8 a 5X10 5
  • positive ⁇ cell transplantation day 28 performs transcardiac perfusion fixed with 4% paraformaldehyde
  • frozen sections were prepared by collecting the spinal cord.
  • immunostaining was performed on BrdU, a marker for cell proliferation, and NeuN, a marker for mature neurons, using an anti-BrdU antibody (Fitzgerald) and an anti-NeuN antibody (Chemicon), respectively.
  • the gray matter on the cranial and caudal sides 250 ⁇ m away from the injured area should be equal to the area of 500 / zm (dorsal-ventral) ⁇ 1000; ⁇ ⁇ (cranial-caudal) with respect to the central tube.
  • a total of 6 cells were determined per mouse, and double positive cells were observed, and the average number of double positive cells per animal was compared.
  • mice ⁇ cells expression of the expression and Notchl of CD8 a, the very high correlation . Therefore, from the results of Example 2, it was considered that a pharmaceutical composition containing mouse Notchl-positive rod cells as an active ingredient is also useful for improving the nerve function caused by nerve damage. Therefore, an experiment similar to that of Example 2 was performed using Notchl-positive rod cells, and the pharmaceutical composition containing mouse Notchl-positive rod cells as an active ingredient improved the motor function caused by nerve damage. Confirmed that it is useful to do.
  • LPS E coli (055: B5) -derived Lipopolysacchride, Sigma
  • mice 2 O / zg / animal
  • mature rod cells were isolated from the spleen.
  • CD11c antibody, Notchl antibody, and CD8a antibody the expression of CDllc positive fraction was analyzed by FACS for the expression of Note hl and CD8a.
  • TR AIZOL TR AIZOL
  • TOYOBO Revatrace cDNA synthesis kit
  • FIG. 9 (A) CDl lc-positive mouse mature rods co-expressed CD8a and Notchl.
  • FIG. 9 (B) Notchl expression was detected only in CD8a-positive cells.Therefore, CD8a and Notchl expression are highly correlated. Indicated.
  • mice motor function recovery was observed based on three different indicators (rare ring, BBB score and slipping test).
  • the slitting test is the same method as the rotor mouth pad, but it has become clear that the detection sensitivity is higher.
  • 3 months after the operation place the mouse on the rotarod measuring instrument, place the mouse on the rotation axis at an acceleration of 2 to 20 rotations Z20 seconds, perform pre-training for 5 minutes, and all the mice are on the rotation axis. After confirming the ride, the analysis was performed on the next day using the same individual. In this analysis, the mouse was placed on a rotating shaft maintained at a speed of 8 rotations Z for 1 minute, and the number of times the left foot slipped on the rotating shaft was measured.
  • the Notchl-positive rod cell transplant group showed a significantly higher score than the Notchl-negative rod cell transplant group at 28 days after transplantation (# p ⁇ 0.05).
  • the Notchl-positive rod cell transplant group showed a significantly higher score than the Notchl-negative rod cell transplant group at 28 days after transplantation (# #p ku 0. 001).
  • Notch-positive rod cells were more effective in improving motor function caused by nerve damage than Notch-negative rod cells.
  • notchl expression and maturation of rod cells are strong in mouse rod cells. Therefore, a pharmaceutical composition containing mature rod cells as an active ingredient is also useful for improving nerve function caused by nerve damage. As shown in this example, since the relationship between Notchl expression and maturation of rod cells is observed in humans, the usefulness of this pharmaceutical composition is similar to that in the formation of neurospheres. It can be said that this also applies to (eg, human CD83-positive rod cells).
  • Example 1 human rod cells were isolated and first separated into CD83-negative immature rod cells and CD83-positive mature rod cells using the maturity marker CD83. , The expression of Notchl was examined by FACS using an anti-Notchl antibody. As shown in FIG. 11, Notchl expression was higher in mature rod cells (FIG. 11B) than in immature rod cells (FIG. 11A). Furthermore, when the expression of CD83 and Notchl was examined in mature rod cells, there was a correlation between the expression of CD83 and Notchl, as shown in the lower part of FIG. 11B. Thus, also in human rod cells, Notchl expression increased with cell maturation.

Abstract

【課題】高効率にニューロスフェアを形成するニューロスフェア形成剤及び神経障害によって障害が生じた神経機能を効率よく改善する医薬組成物を提供すること。  【解決手段】マウスCD8α陽性樹状細胞、成熟樹状細胞、Notch陽性樹状細胞を分離し、それらを単独に、あるいは複数含有するニューロスフェア形成剤または医薬組成物とする。ニューロスフェア形成剤が含有する樹状細胞を、神経幹細胞と共培養することにより、高効率にニューロスフェアを形成することができる。また、医薬組成物を神経損傷部分に投与することにより、障害が生じた神経機能を効率よく改善することができる。

Description

明 細 書
ニューロスフヱァ形成剤
技術分野
[0001] 本発明は、成熟型及び Z又は Notch陽性榭状細胞を含有するニューロスフェア形 成剤及び神経損傷によって障害が生じた神経機能を改善する医薬組成物に関する 背景技術
[0002] 脊髄損傷の治療法としては、物理的な圧迫や障害部位を外科的手術により除去す る方法や、受傷急性期の脊髄浮腫に対するステロイド療法などがあるが (Altinors, N. et al., J. Neurosurgery vol.93, pl_8, 2000)、いずれも決定的に有効な治療法では ない。
[0003] 近年、新 ヽ脊髄損傷治療法として、抗原提示に重要な役割を果たす免疫細胞で ある榭状細胞 (Dendritic cell, DC)を脊髄に移植する治療法が開発された(国際特 許出願 PCT/JP03/03868)。この発明は、マウス脾臓細胞より調整した榭状細胞 (CD 1 lc陽性榭状細胞)を、マウス脊髄損傷モデルに移植することにより顕著な運動機能 改善が認められるという報告(Mikami Y. et al., J. Neurosci. Res., vol.76, p.453- 465, 2004)に基づくものである。この報告において、榭状細胞における神経栄養因子 (サ イト力イン)等の発現や、 in vitroおよび in vivoにおける榭状細胞による神経幹細胞の 増殖効果より、上記運動機能改善の作用機序として、榭状細胞が損傷脊髄に存在 する内在性神経幹細胞を活性ィ匕し、神経新生が誘導されることが考えられた。なお、 この報告は、成熟哺乳類の脊髄において榭状細胞を移植することにより、初めて神 経新生を誘導することを明らかにしたものである。
[0004] 一方、榭状細胞はマウス'ヒトにおいて、その表面マーカーの発現および生物学的 機能により幾つかのサブタイプに分類されている (Liu, Y.J., Cell vol.106, p.259-62, 2001)。しかし、榭状細胞のサブタイプが上記運動機能改善作用とどのように関係す るかは明らかではなかった。
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] そこで、本発明は、榭状細胞のサブタイプとそれぞれの-ユーロスフェア形成能ま たは神経機能改善能を明らかにすることを通じて、高効率に-ユーロスフェアを形成 するニューロスフ ア形成剤及び障害が生じた神経機能を効率よく改善する医薬組 成物を提供することを目的としてなされた。
課題を解決するための手段
[0006] 発明者らは、榭状細胞のサブタイプとそれぞれの-ユーロスフェア形成能の関連を 調べた結果、マウス CD8 a陽性榭状細胞は、 CD8 a陰性榭状細胞に比べ、ニュー ロスフェア形成能が高いことを見出した。
[0007] マウス榭状細胞では、 CD8 a陽性榭状細胞が生体にお!、て CD8 a陰性榭状細胞 より成熟度が高い存在として知られている(Ardavin C, Trends Immunol. 22, 691-70 0, 2001)。そこで、成熟榭状細胞に関して-ユーロスフェア形成能を調べたところ、未 成熟榭状細胞より-ユーロスフェア形成能が高いことが明らかになった。
[0008] CD8 a陽性榭状細胞および CD8 a陰性榭状細胞における-ユーロスフェア形成 能の違いを分子的基盤において解明するために、 RT-PCRにより種々の遺伝子発現 の違 、を調べたところ、神経幹細胞の幹細胞性維持に重用な機能を有して 、る Note hiの発現が、 CD8 a陽性榭状細胞で顕著に高ぐ CD8 a陰性榭状細胞ではほとん ど検出されないことが明ら力となった。このことは、 CD8 a陽性榭状細胞のサブダル ープ中に Notchl陽性榭状細胞のサブグループが存在している力、あるいは、これら のサブグループがほぼオーバーラップしていることを示す。
[0009] そこで、榭状細胞の成熟度に再び着目して、マウス脾臓由来榭状細胞にぉ 、て in vitroおよび in vivo成熟化条件で、 Notchlの発現を FACS解析により調べたところ、成 熟化に伴い Notchlの発現が亢進することが明ら力となった。
[0010] 一方、ヒト榭状細胞のサブタイプ分類では、マウス CD8 a陽性榭状細胞に厳密に 対応するサブタイプは同定されていない。そこで、ヒトにおける榭状細胞成熟度のマ 一力一である CD83と Notchlの発現の関連を解析したところ、 CD83陽性細胞は Not chlを高発現し、ヒトにおける榭状細胞未成熟度のマーカーである CDlaの発現が低 下していることが明らかになった。これは、マウスにおいて、成熟化条件においた榭 状細胞で Notchlの発現が亢進するという結果を支持する。
[0011] これらの知見により、 Notchlの発現が榭状細胞の成熟度と関連することが明らかに なり、同時に Notchlの発現と-ユーロスフェア形成能との関連性が示唆された。実際 、 Notchl陽性榭状細胞について-ユーロスフェア形成能を調べてみると、 Notchl陰 性細胞より-ユーロスフェア形成能が有意に高いことが明らかになった。こうして、発 明者らは、本発明の完成に至った。
[0012] 以上のように、本発明に力かる-ユーロスフェア形成剤は、マウス CD8 a陽性榭状 細胞を有効成分として含む。
[0013] また、本発明に力かる-ユーロスフェア形成剤は、成熟榭状細胞あるいは Notch陽 性榭状細胞を有効成分として含んでもょ ヽ。前記 ヽずれの榭状細胞もマウス由来で あってもよいし、ヒト由来であってもよいが、由来はこれらに限定されない。また、前記 マウス CD8 a陽性榭状細胞及び前記成熟榭状細胞は、 Notch陽性であってもよい。
[0014] 本発明にかかる神経損傷によって障害が生じた神経機能を改善する医薬組成物 は、マウス CD8 a陽性榭状細胞を有効成分として含む。前記神経機能は運動機能 でも良い。また、前記神経損傷は、脊髄損傷でもよい。
[0015] また、前記医薬組成物は、成熟榭状細胞ある!、は Notch陽性榭状細胞を有効成分 として含んでもよい。前記いずれの榭状細胞もマウス由来であってもよいし、ヒト由来 であってもよいが、由来はこれらに限定されない。また、前記マウス CD8 α陽性榭状 細胞及び前記成熟榭状細胞は、 Notch陽性であってもよ 、。
[0016] また、本発明に力かる榭状細胞サブタイプのマーカーは、 Notch遺伝子関連物質で ある。ここで、遺伝子関連物質とは、遺伝子及びそれが転写'翻訳されてできる物質 であれば何でもよぐ例えば、遺伝子をコードするゲノム DNA、 cDNA、及びそれら の相補鎖、転写物である mRNA、翻訳されてできるポリペプチド及びタンパク質など が挙げられる。
[0017] 以上のいずれの場合も、 Notchは Notchlであることが好ましい。
[0018] ——関連文献とのクロスリファレンス——
なお、本出願は、 2005年 2月 9日出願の日本国出願番号特願 2005— 033698の 優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。 図面の簡単な説明
[図 1]本発明にかかる一実施例において、マウス脊髄由来神経幹細胞とマウス線状 体由来神経幹細胞の、榭状細胞存在下におけるニューロスフェア形成能を比較した 結果を表すグラフである。
[図 2]本発明にかかる一実施例において、マウス脾臓由来未熟榭状細胞に含まれる CD8 a陽性榭状細胞の-ユーロスフェア形成能を測定した結果を表すグラフである
[図 3]本発明にかかる一実施例において、マウス CD1 lc陽性成熟榭状細胞による- ユーロスフエア形成能を測定した結果を表すグラフである。
[図 4]本発明にかかる一実施例において、マウス CD8 a陽性成熟榭状細胞による- ユーロスフエア形成能を測定した結果を表すグラフである。
[図 5]本発明に力かる一実施例において、マウス Notch陽性榭状細胞による-ユーロ スフエア形成能を測定した結果を表すグラフである。
[図 6]本発明に力かる一実施例において、ヒト Notch陽性榭状細胞による-ユーロスフ エア形成能を測定した結果を表すグラフである。
[図 7]本発明にかかる一実施例にお!ヽて、マウス脾臓由来 CD11陽性細胞および C D8 a陽性榭状細胞移植による、脊髄損傷モデルマウスにおける行動機能回復実験 の結果を表すグラフである。レアリング (A)、 BBBスコア (B)は、経時的観察の結果を、 ロータロッドテスト(C)は手術後 56日における解析結果を示す。
[図 8]本発明にかかる一実施例において、組織学的解析により、マウス脊髄損傷モデ ル〖こおける CD8 a陽性榭状細胞移植後の増殖を調べた結果を示す図である。
[図 9A]本発明にかかる一実施例において、マウス榭状細胞における CD8 α及び Not chlの発現の相関を、 FACSで解析した結果を示す図である。
[図 9B]本発明に力かる一実施例において、マウス榭状細胞における CD8 α及び Not chlの発現の相関を、 RT— PCRで解析した結果を示す図である。
[図 10]本発明にかかる一実施例において、マウス脾臓由来 Notchl陽性榭状細胞移 植による、脊髄損傷モデルマウスにおける行動機能回復実験の結果を表すグラフで ある。レアリング (A)、 BBBスコア (B)は、経時的観察の結果を、スリツビングテスト (C) は手術後 3ヶ月目における解析結果を示す。
[図 11]本発明に力かる一実施例において、ヒト榭状細胞における CD83及び Notchl の発現の相関を、 FACSで解析した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 実施の形態及び実施例に特に説明がな!、場合には、 J. Sambrook, E. F. Fritsch &
T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold bpnng Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Prot ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に 記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬 キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコ ールを用いる。
[0021] なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、 当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を 再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本 発明の好ま 、実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されて 、るの であって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本 発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾が できることは、当業者にとって明らかである。
[0022] = =ニューロスフェア形成剤の構成 = =
通常、細胞障害性 T細胞において発現している細胞表面分子 CD8 aのマウス榭 状細胞における発現は、解剖学的かつ機能的に異なった榭状細胞のサブセットを識 別するために用いられている。そのサブセットの中で、 CD8 a陽性榭状細胞は、神 経幹細胞と共培養されたとき、 CD8 a陰性細胞より効率よく-ユーロスフェアを形成 することができる。
[0023] また、成熟榭状細胞は、未成熟榭状細胞より効率よくニューロスフェアを形成するこ とができる。これは、成熟条件下においたマウス榭状細胞が未成熟榭状細胞より効率 よく-ユーロスフェアを形成することができることから示される。 [0024] また、榭状細胞は、 Notchlの発現レベルによって、高レベルに発現しているサブセ ット(Notchl陽性)と低レベルに発現しているサブセット(Notchl陰性)に分類できる。 マウスの場合、 CD8 a陽性榭状細胞は CD8 a陰性榭状細胞より、 Notchlを高レべ ルに発現しているため、 Notchlの発現レベルによって分類されたサブセットと CD8 a の発現によって分類されたサブセットはかなりオーバーラップしていると考えられる。ヒ トの場合、マウス CD8 a陽性榭状細胞に厳密に対応するサブタイプは同定されてい ないが、 Notchlの発現レベルによる分類は可能であり、 Notchlを高レベルに発現し ている榭状細胞は、 Notchlを低レベルに発現している榭状細胞より効率よく-ユーロ スフエアを形成することができる。 Notchlを高発現しているマウス CD8 a陽性榭状細 胞または成熟榭状細胞は、特に好ましい。
[0025] Notchシグナリングは、ヒト単球由来の榭状細胞の成熟に重要な役割を果たしてい ることが明らかになつている(Weijzen et al" J. Immunol 169, 4273-4278, 2002)が、 N otchl欠損マウスにおいては榭状細胞の成熟に異常がない(Radtke et al., J. Exp. M ed. 191, 1085, 2000)ことから、他の Notch分子が発現し、 redundantな機能を担って いると考えられる。従って、 Notchlだけでなぐ Notch-familyの他のメンバー(例えば、 Notch2〜4)であっても、成熟榭状細胞で高発現して!/、るものであれば構わな!/、。
[0026] このように、本発明に力かる-ユーロスフェア形成剤は、より効率よく-ユーロスフエ ァを形成することができるマウス CD8 a陽性榭状細胞、成熟榭状細胞、 Notch (特に Notchl)を高発現して 、る榭状細胞を、単独であるいは複合して含有する。
[0027] ニューロスフェア形成剤は、典型的にはこれらの榭状細胞が緩衝液や培地などに 懸濁されている液体調製剤であるが、その榭状細胞を含有していればよぐ形状はこ れに限定されない。ニューロスフェア形成剤は、榭状細胞以外に、コラーゲン、グリセ ロール、 DMSO、糖、防腐剤など、様々なキャリアや添加剤を含有してもよい。
[0028] = =医薬組成物 = =
上記-ユーロスフェア形成剤として適当な榭状細胞は、神経損傷によって障害が生 じた神経機能を改善する医薬組成物に有効成分として含有させることができる。即ち 、本発明にかかる医薬組成物は、マウス CD8 a陽性榭状細胞、成熟榭状細胞、 Not ch (特に Notchl)を高発現して 、る榭状細胞を、単独であるいは複合して含有する。 Notch (特に Notchl)を高発現している CD8 a陽性榭状細胞及び成熟榭状細胞は、 特に好ましい。
[0029] 本医薬組成物は、典型的にはこれらの榭状細胞が緩衝液や培地などに懸濁されて いる液体調製剤であるが、その榭状細胞を含有していればよぐ形状はこれに限定さ れない。医薬組成物は、榭状細胞以外に、コラーゲン、グリセロール、 DMSO、糖、 防腐剤など、様々なキャリアや添加剤を含有してもよい。
[0030] = =榭状細胞各サブタイプの調製 = =
本発明で用いられる榭状細胞の由来は、ヒト及びヒト以外の脊椎動物であれば何で もよい。(本明細書において、動物名で限定していない榭状細胞の由来は、特に限 定されないものとする。 )
榭状細胞は、体中に広く分布しており、どの組織力 調整してもよいが、脾臓、血液 、骨髄から調整するのが好ましい。脾臓からは、直接榭状細胞を分離するが、末梢血 や骨髄からは一定条件下で榭状細胞に分化誘導させた後、サブタイプのマーカーを 指標に、各サブタイプの榭状細胞を分離する。分離方法は、特に限定されないが、 抗体とのァフィ-ティを利用した方法が好ましい。例えば、 CD8 a、 CD11, CD83、 Notchl等に対する抗体を用い、カラム方式やバッチ方式で、各マーカーを有する細 胞を単離できる。また、蛍光色素が結合した抗体を用いて、 FACSで各マーカーを 細胞表面に発現する細胞を分離できる。
[0031] なお、複数の抗体を用いることにより、複数の表面抗原を同時に発現している榭状 細胞を単離することも可能である。
[0032] また、分離前に、榭状細胞に成熟化させる処理を施すことで、成熟榭状細胞を効率 よく得ることができる。例えば、ヒト榭状細胞を成熟化させるためには、培養 5日目に O K— 432で刺激すればよいが、その方法は特に限定されない。
[0033] こうして分離された榭状細胞は、ニューロスフェア形成剤や医薬組成物を作製する 際、マイトマイシン C処理や UV処理や放射線処理等により、増殖しないように処理し てもよい。
[0034] = =ニューロスフェアの形成 = =
神経幹細胞の培養及び-ユーロスフェアの形成は、基本的には、 Weissらにより確 立された培養法(Reynolds et al., Science 255, 1707-10, 1992)に基づく。即ち、中枢 神経系組織から単離した細胞を、成長因子 (EGF、 FGF、など)を含む培地で浮遊 培養させることにより、ニューロスフェア (神経細胞塊)を形成することができ、ある程 度細胞塊が大きくなると、再び単一細胞に解離して、継代することができる。
[0035] ここで、神経幹細胞の由来となる組織は、神経幹細胞が含まれる中枢神経系組織 ( 神経上皮、神経管、大脳皮質、線条体、嗅球、 SVZ (subventricular zone、 ι¾ ¾困 状回(hippocampal dentate gyrus)、脊髄など)であれば限定されない。
[0036] これらの組織から得られた神経幹細胞を、ニューロスフェア形成剤に含有された榭 状細胞と共培養することにより、ニューロスフェアをより効率よく形成させることができ る。その細胞数の比率は、神経幹細胞 200個:榭状細胞 105個であることが好ましい。
[0037] = =医薬組成物の投与 = =
分離された榭状細胞を有効成分として含有する医薬組成物は、神経損傷によって 障害が生じた神経機能を改善することができる。
[0038] 治療対象である神経損傷は、中枢神経系の損傷であれば限定されず、脳損傷であ つても脊髄損傷であっても構わない。両者共に、神経幹細胞から分化し、榭状細胞 は神経幹細胞の増殖を支持できるからである。
[0039] 例えば、そのような神経損傷の原因疾病として、脳血管障害、脊髄血管障害、脳 · 脊髄腫瘍、脊椎疾患による神経障害、感染症疾患、痴呆性疾患、代謝,中毒性疾患 、基底核変性疾患、脊髄小脳変性疾患、運動ニューロン疾患、末梢神経疾患、脱髄 疾患、筋疾患、および、先天異常などが考えられ、具体的には例えば、歩行障害、起 立障害、痙攣、舞踏病、バリズム、ジストニア、てんかん、ミオクローヌス、チック、脳出 血、脳血栓症、脳塞栓症、脳梗塞、脳卒中、脳虚血、 Binswanger病、片麻痺、四肢麻 痺、運動失調、脊髄梗塞、脊髄静脈性梗塞、脳腫瘍、脊髄腫瘍、脳炎、脳膿瘍、結 核腫、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆、 Wilson病、肝レンズ核変性症、 Men kes病、アミロイド一シス、スフインゴリビドーシス、アミノ酸代謝異常症、ビタミン欠乏症 、アルコール症、アルコール性神経障害、有機溶剤中毒、スモン、進行性核上性麻 痺、線条体黒質変性症などが挙げられるが、特にこれらに限定されず、神経損傷を 生じる疾病であれば、どんなものでもよい。 [0040] このような上記榭状細胞を含有する医薬組成物を、神経損傷部位に移植する。移 植方法は、常法に従えばよぐ移植細胞量や移植回数などは適宜判断され、特に限 定されない。
実施例
[0041] <実施例 1 >
= =神経幹細胞の培養 = =
胎生 14日のマウス胎仔終脳の線条体及び脊髄を採取し、それぞれ、 DMEM/F12 培地に EGF (20ng/ml、 Peprotech社)、 FGF2 (10ng/ml、 Peprotech社)、インシュリン(2 5 μ g/ml、 Sigma社)、プロゲステロン(20nM、 Sigma社)、セレン酸ナトリウム(30nM、 Sig ma社)、プトレスシン(60 μ M、 Sigma社)を添カ卩したマウス神経幹細胞培養用培養液 を用い、 2xl05細胞/ mlの細胞密度で播種した。その後、 5— 7日培養することで、神 経幹細胞を含む細胞塊 (ニューロスフ ア)を選択的に培養した。この神経幹細胞力 ルチヤー(ニューロスフェアカルチャー)を 5日毎に継代培養し、以下の実験を行った 。なお、継代には Accumax (Inovative cell technologies社)を用い、酵素処理後(37 。C、 10分)物理的に細胞を解離し、 DMEM/F12培地を用いて細胞を洗浄した後、上 記マウス神経幹細胞培養培地を用いて、 50個/ / z 1の細胞密度で新しいプレートに播 種した。
[0042] ヒト神経幹細胞は、中絶胎児脳より確立した神経幹細胞株を、慶應義塾大学医学 部倫理委員会の規定に従って培養したものを使用した。ヒト神経幹細胞培養培地に は、 DMEM/F12(1 ;1)— bases medium(Invitrogen社)中に、 hrFGF2 (20ng/ml、 PeproTec h社)、 hrEGF (20ng/ml、 Peprotech社)、 hrLIF (10ng/ml、 Chemicon International社) 、 Heparin (5 μ g/ml、 Sigma社)、 15mM HEPES (Invitrogen社)、 penicilin (100U/ml、 In vitrogen社)、 Streptomycin (100 μ g/ml、 Invitrogen社)、 B27 supplement (Invitrogen 社)、 amphotericib B (250ng/ml、 Invitrogen社)を添カ卩した培地を用いた (J .Neurosci. Res. 69; 869-879, 2002)。
[0043] = =榭状細胞の分離= =
マウス榭状細胞を C57BL/6成熟マウス脾臓より以下のように調整した。マウス脾臓 を摘出したのちメスにより細断し、コラゲナーゼ(100U/ml、 Sigma社)にてホモジェナイ ズした後、 37°Cにて 20分間インキュベートし細胞を解離した。この細胞をセルストレ ーナー(100 μ m、 BDFalcon社)に通過させた後、遠心して 28%BSA ( p =1.080)溶液中 に浮遊させ、さらに遠心管中にて RPMI培地を重層後 8500回転 15分遠心し、 BSA溶 液と RPMI間の中間層にある細胞分画を回収した。
[0044] この細胞分画から、それぞれのマウス榭状細胞サブタイプに応じて MACSビーズ (M iltenyi Biotec社)を用いて回収した。すなわち、 CDl lc(N418)磁気ビーズ、 CD8 a + Dendritic Cell Isolation kitを用い、上記細胞分画から、それぞれ CDl lc陽性榭状 細胞 (以下、榭状細胞と記す)、 CD8 a陽性榭状細胞を分離した。 CD8 a陰性榭状 細胞は CD8 a陽性榭状細胞を回収した残りの分画力 CDl lc磁気ビーズを用いて 回収した(Fukao T" Immunology 164, 64-71, 2000)。なお、 CDl lcは、榭状細胞の マーカーとして知られて 、る。
[0045] また、マウス成熟榭状細胞の誘導は、未成熟榭状細胞を R10培地(RPMI+10%FCS )で 3時間培養したのち浮遊細胞を除き、さらに R10培地で一晩培養することによつ て行!ヽ、得られた細胞を成熟榭状細胞とした。
[0046] また、マウス Notchl陽性榭状細胞を得るために、上記細胞分画から、 PE結合抗 CD 1 lc抗体(e- Bioscienses社)、ゥサギ抗 Notchl抗体(Santa cruz社)および FITC結合 抗ゥサギ IgG抗体(Beckman coulter社)を順次反応させた後、 Moflo (Modular Flow, Dako cytometer社)を用いて FITC陽性の Notchl陽性細胞を分離した。
[0047] ヒト榭状細胞は、ヒト末梢血より分離した。ヒト末梢血をリンフォプレップ (Axis-Shield PoC AS社)に重層した後、遠心して単核球を含む中間層を回収した。これを CD14 磁気ビーズにて、 CD14陽性単球を分離したのち、 hrGM- CSF及び hrIL- 4 (各 100ng /ml、 Peprotech社)を含む R10培地で 5X105/mlで播種し、 7— 8日培養し、ヒト未成熟 榭状細胞を得た(Araki H., British J Haematology 114, 681-89, 2001)。なお、ヒト榭 状細胞の成熟化は、この CD14陽性単球の培養 5日目に OK— 432 (中外製薬、 0.1 KE/ml)で刺激することにより行い、成熟化のマーカーである CD83に対する抗体を 用いて、成熟榭状細胞を純化した。
[0048] ヒト Notchl陽性榭状細胞を得るためには、上記ヒト榭状細胞を PE結合抗 CDla抗体
(BD Bioscienses社)、およびゥサギ抗 Notchl抗体(Santa cruz社)、 FITC結合抗ゥサ ギ IgG抗体を順次反応させた後、 Mofloを用いて PE及び FITC陽性細胞を分離した (C Dlaはヒト榭状細胞マーカー、 Liu YJ, Cell 106, 259-262, 2001参照)。 Notchl陽性 成熟榭状細胞を調製するためには、 OK-432刺激した培養榭状細胞を PE結合抗 CD 83抗体(BD Bioscienses社)、 およびゥサギ抗 Notchl抗体(Santa cruz社)、 FITC結 合抗ゥサギ IgG-FITC抗体を順次反応させた後、 Mofloを用いて PE及び FITC陽性細 胞を分離した。
[0049] = =神経幹細胞と榭状細胞の共培養 = =
マウス胎児終脳線条体由来および脊髄由来神経幹細胞を Accumax (Inovative cell technologies社)にて 37°C10分間酵素処理して、単一細胞に解離した後、セルソータ 一(Epics Altra,ベックマンコールタール社)にて PI (Propidium Iodide)陰性で直径 10 mm前後の単一細胞を選択し、神経幹細胞用培地を満たした低接着性 96穴プレート (コースター社)にそれぞれ 200個ずつ添加した (クローナル密度)。各ゥエル内で、 C Dl lc陽性榭状細胞 105個と共培養し、榭状細胞を加えな!/、群 (コントロール)と比較 して、ニューロスフェア形成数 (直系 50 μ m以上の細胞塊)を培養開始 10— 14日後 に比較したところ、神経幹細胞の由来に関わりなぐ 2. 5— 3倍の-ユーロスフェア形 成能の増加が観察された(図 1)。このことから、中枢神経系の異なる組織由来の神経 幹細胞であっても榭状細胞に対する反応性は同じであると考えられたので、以下の マウス実験系を用 、た実験には、マウス線条体由来細胞を用 、た。
[0050] マウス脾臓由来の榭状細胞は、 CD8 aの発現を指標に、 CD8 a陽性榭状細胞と CD8 a陰性榭状細胞に分類できる。そこで、これらのサブタイプに-ユーロスフェア 形成能の違いがあるかを検討した。その結果、分画前の榭状細胞が、コントロール( 榭状細胞の添加無し)に比べ 2倍程度の-ユーロスフェア形成能であつたのに対し、 CD8 a陽性榭状細胞が、コントロールの 8倍程度という顕著に高い-ユーロスフェア 形成能を有していることが明ら力となった(図 2)。このことは、高効率に-ユーロスフエ ァを形成する-ユーロスフェア形成剤として、マウス CD8 a陽性榭状細胞を有効成 分として含む-ユーロスフェア形成剤が有用であることを示す。
[0051] また、榭状細胞はサブタイプのみならず、成熟度に応じても機能が異なることが知ら れているので、榭状細胞における成熟度の違いによる-ユーロスフェア形成能の違 いを検討した。まず、マウス CDl lc陽性榭状細胞を用い、成熟化を誘導して、未成 熟榭状細胞とニューロスフェア形成能を比較したところ、成熟榭状細胞のほうが有意 に高い-ユーロスフェア形成能を示した(図 3)。また、マウス CD8 a陽性榭状細胞を 用い、成熟化を誘導して、未成熟榭状細胞とニューロスフェア形成能を比較したとこ ろ、同様に成熟榭状細胞のほうが有意に高い-ユーロスフェア形成能を示した(図 4) 。このことは、高効率に-ユーロスフェアを形成する-ユーロスフェア形成剤として、成 熟榭状細胞を有効成分として含む-ユーロスフ ア形成剤が有効であることを示す。
[0052] 次に、 Notchlの発現の違いに対する-ユーロスフェア形成能の違いを検討した。発 明者らは、マウス及びヒト榭状細胞の成熟度と関連して、 Notchlの発現が高くなること を明らかにした。そこで、マウス榭状細胞について Notchl陽性分画と陰性分画に分 画し、ニューロスフェア形成能を比較した。またヒト CD83陽性榭状細胞についても、 Notchl陽性分画と陰性分画に分画し、ニューロスフェア形成能を比較した。ここでは 、コントロールとして、 CD83陰性かつ Notchl陰性榭状細胞、及び榭状細胞無しのネ ガティブコントロールを用いた。なお、ここで、榭状細胞成熟マーカーとして CD83を 用いたが(Hagihara M, Leuk Res 25, 249-58, 2001)、この培養系において CD83陽 性細胞は MHC ClassIIの高い発現を示したため、成熟榭状細胞であることが確認さ れた。この実験の結果、マウスの系においても(図 5)、ヒトの系においても(図 6)、 Not chl陽性榭状細胞は、コントロールと比べ、有意に高い-ユーロスフェア形成能を示し た。このことは、 Notchlが榭状細胞サブタイプの新規マーカーとして有用であること、 及び高効率に-ユーロスフェアを形成する-ユーロスフェア形成剤として、 Notchl陽 性榭状細胞を有効成分として含む-ユーロスフェア形成剤が有効であることを示す。 なお、ヒト細胞を用いた共培養系では、榭状細胞に対し 40Gray量の放射線照射を行 い、増殖を止めた後で共培養実験に供した。
[0053] <実施例 2 >
= =マウス脊髄損傷モデルの作製 = =
C57BL/6成熟マウス (6週齢)を麻酔し、第 8胸椎椎弓切除を行い、尖刀にて脊髄を 左半切した脊髄損傷モデルを作製した。損傷部位に、実施例 1と同様に得られた 5x 105個の CDl lc陽性榭状細胞及びそこカゝら分離した CD8 a陽性榭状細胞をゲルフ オーム(変性コラーゲン)とともに、移植した。コントロールには、 RPMI培地を用いた。 なお、動物実験は、慶應義塾大学動物実験委員会のプロトコールに従って行われた
[0054] = =マウス脊髄損傷モデルの行動機能解析 = =
(1)レアリングテスト
本機能解析では、 60x60cmの黒い底のプラスチックボックスにマウスを入れ、立ち上 カ^行動の回数を調べた(Mikami, J Neurosurg 97, 142-147, 2002) 0すなわち、測定 には SCANET (Toyo Sangyo Co. Ltd..)を用い、マウスを 10分間ボックス内に入れて 自由に行動させ、移動距離および下肢のみによる立ち上がり行動を機械的に測定し た。
[0055] (2) BBBスコア
本機能解析では、 60x60cmのプラスチックボックスにマウスを入れて 10分間自由に 7舌 1 せ、 BBB score (Basso— Beattie—Bresnahan locomotor rating scale)【こ つき卜 肢麻痺の程度を 0-21点で評価し、下記の基準にて点数をつけた(Basso DM, J. Neu rotrauma 12: 1-21, 1995)。なお、点数を客観的にするため、群をブラインドで評価し 、何度かの平均点を用いた。
[0056] 0-7 : isolated hindioilmb joint movements
8— 13 、: frequency of stepping and coordination
14- 21点: paw ratation and dragging of the toes
[0057] (3)ロータロッドによる解析
本解析では、手術後 56日目に、ロータロッド測定機 (Rota-rod Treadmil BASILE M odel No.7650, UGOBASILE)にマウスをのせ、一定速度の回転でマウスが持続して口 ータ上にとどまりうる時間を計測した。
[0058] (4)結果
マウス脊髄損傷モデルにぉ 、て、 CD1 lc陽性榭状細胞及びそこ力 分離した CD 8 a陽性榭状細胞の移植による運動機能回復を 3つの異なった指標(レアリング、 BB Bスコアおよびロータロッド)に基づいて観察した。その結果、図 7に示すように、 CD8 a陽性榭状細胞は、分離前の CDl lc陽性榭状細胞より、高い運動機能改善効果を 示すことが明らかになった。
[0059] なお、統計処理としては、ここに示されたデータに対して Student-t検定 (独立 2群) を行 ヽ、図 7にお 、てそれぞれコントロールの RPMI (培養液のみ)と比較した結果を 、 P*<0.05, P**<0.01, P***〈0.005で表記した。
[0060] この結果は、マウス CD8 a陽性榭状細胞を有効成分として含有する医薬組成物は 、神経損傷によって障害が生じた運動機能を改善するのに有用であることを示す。こ の医薬組成物は、運動機能だけでなく感覚機能などの行動機能であっても、神経障 害によって生じた機能障害であれば、改善するのに有用であると考えられる。
[0061] = =マウス脊髄損傷モデルにおける CD8 a陽性榭状細胞移植後の組織学的解析 脊髄損傷マウスに移植した榭状細胞による神経再生効果を解析するため、移植脊 髄損傷マウスにぉ 、て、新生された神経細胞の細胞数を調べた。
[0062] まず、上述した脊髄損傷モデルマウスに、脊髄損傷当日を含めて 6日間、 BrdU (50 mg/Kg)を腹腔内投与した。 CDl lcおよび CD8 a (5X105)陽性榭状細胞移植 28日目 に、 4%パラホルムアルデヒドで経心臓的灌流固定を行い、脊髄を回収して凍結切片 を作製した。その後、細胞増殖のマーカーである BrdU及び成熟神経細胞のマーカ 一である NeuNに対し、それぞれ抗 BrdU抗体(Fitzgerald社)および抗 NeuN抗体(Che micon社)を用いて免疫染色を行った。損傷部位より 250 μ m離れた頭側及び尾側の 灰白質を、中心管を基準として 500 /z m (背側-腹側方向 ) χ1000 ;ζ πι (頭側-尾側 方向)のエリアを一匹あたり計 6ケ所定め、 2重陽性細胞を観察し、それぞれ一匹あた りの 2重陽性細胞総数の平均を比較した。
その結果、 CD8 a陽性榭状細胞移植群では CDl lc榭状細胞移植群およびコンロ ール群 (RPMI移植群)と比較して NeuN/BrdU陽性細胞の有意な増加を認めた(図 8) 。したがって、これまで神経新生は不可能であると考えられてきた哺乳類成体脊髄に おいて、 CD8 a陽性榭状細胞の移植は、 CDl lc榭状細胞移植と比較して、脊髄損傷 後により多くの神経細胞を新生させることが明らかになった。
[0063] <実施例 3 >
マウス榭状細胞において、 CD8 aの発現と Notchlの発現は、非常に相関性が高い 。従って、実施例 2の結果より、マウス Notchl陽性榭状細胞を有効成分として含有す る医薬組成物も、神経損傷によって障害が生じた神経機能を改善するのに有用であ ると考えられた。そこで、 Notchl陽性榭状細胞を用いて、実施例 2と同様の実験を行 い、マウス Notchl陽性榭状細胞を有効成分として含有する医薬組成物は、神経損傷 によって障害が生じた運動機能を改善するのに有用であることを確認した。
[0064] = =榭状細胞における CD8 a及び Notchlの発現解析 = =
マウスに、 LPS (E coli(055:B5)- derived Lipopolysacchride, Sigma)を腹腔内投与(2 O /z g/匹)し、 24時間後に脾臓より成熟榭状細胞を分離し、実施例 1と同様に CD11 c抗体、 Notchl抗体、 CD8 a抗体により標識した後、 CDl lc陽性分画について Note hl、 CD8 aの発現を FACSで解析した。
[0065] また、 CD8 a陽性細胞と陰性細胞と、それぞれにおける Notchlの発現を、以下の ように RT— PCRで調べた。まず、分離したそれぞれの榭状細胞より、全 RNAを TR AIZOL (GIBCO社)により調整したのち、各 RNA1 μ gを cDNA合成に使用した。 c DNA合成には Revatrace cDNA synthesis kit (TOYOBO社)を用い、各々の組み合 わせの PCRプライマー、
Notchl:
Sense CCAGCATGGCCAGCTCTGG (配列番号 1)
antisense CATCCAGATTCTGTGGCCCTGTT (配列番号 2)
alectin-1:
sense CGCCAGCAACCTGAATCTCAAACC (配列番号 3)
antisense GGCCACGCACTTAATCTTGAAGTCTC (配列番号 4)
b-actin:
sense ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG (配列番号 5) antisense CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC (配列番号 6) を用いて、(94°C30秒、 56°C40秒、 72°C40秒、 35サイクル)で反応を行なった。
[0066] 図 9 (A)〖こ示すように、 CDl lc陽性のマウス成熟榭状細胞は CD8 aおよび Notchl を共発現していた。また、図 9 (B)に示すように、 CD8 a陽性の細胞においてのみ、 Notchlの発現が検出された、従って、 CD8 aと Notchlの発現は相関性が高いことが 示された。
[0067] = =マウス脊髄損傷モデルの行動機能解析 = =
細胞は、実施例 1と同様にして得られた CDl lc陽性榭状細胞 (106個: n=14),及び N otchl陽性榭状細胞 (106個; n=17)を用いた以外は、実施例 2と同様にマウス脊椎損 傷モデルを作製した。
[0068] これらのマウスに対し、運動機能回復を 3つの異なった指標(レアリング、 BBBスコア およびスリツビングテスト)に基づいて観察した。解析に関しては、レアリングテスト及 び BBBスコアによる評価は、実施例 2と同様に行った。スリツビングテストは、ロータ口 ッドと同様の手法であるが、より検出感度が高いことが明らかになつている。まず、手 術後 3ヶ月目にロータロッド測定器にマウスをのせ、 2〜20回転 Z20秒の加速度に て回転軸にマウスをのせて 5分間のプレトレーニングを行い、すべてのマウスが回転 軸に乗ることを確認後、翌日に同じ個体を用いて本解析を行った。本解析では、 8回 転 Z分の速度に維持した回転軸にマウスを 1分間のせ、回転軸上で左足が滑った回 数を測定した。
[0069] = =結果 = =
レアリングテストでは、図 10 (A)に示すように Notchl陽性榭状細胞移植群は、移植 後 28日において、 Notchl陰性榭状細胞移植群と比較して、有意に高いスコアを示し た(#p〈0.05)。
[0070] BBB scoreでは、図 10 (B)に示すように、 Notchl陽性榭状細胞移植群は、移植後 2 8日において Notchl陰性榭状細胞移植群に比べ有意に高いスコアを示した (##pく 0. 001)。
[0071] 神経損傷手術から 3ヶ月後のスリツビングテストでは、図 10 (C)に示すように、 Notch 1陽性榭状細胞移植群は、 Notchl陰性榭状細胞移植群と比べて、マウスが足を滑ら せる回数が減る傾向にあった。
[0072] このように、 Notch陽性榭状細胞は、 Notch陰性榭状細胞に比べ、神経損傷によつ て障害が生じた運動機能を改善するのに、より有効であることが確認された。
[0073] <実施例 4 >
上記のように、マウス榭状細胞において、 Notchl発現と榭状細胞の成熟化には強 い関連性が見出されるため、成熟榭状細胞を有効成分として含有する医薬組成物も また、神経損傷によって障害が生じた神経機能を改善するのに有用である。本実施 例で示すように、この Notchl発現と榭状細胞の成熟化の関連性は、ヒトにおいても観 察されるので、ニューロスフェア形成能と同様、この医薬組成物の有用性はヒトの系( 例えば、ヒト CD83陽性榭状細胞など)にも当てはまると言える。
[0074] = =ヒト榭状細胞の成熟化に伴う Notchlの発現亢進 = =
実施例 1と同様に、ヒト榭状細胞を単離し、まず、成熟度のマーカーである CD83を 利用して、 CD83陰性未成熟榭状細胞と CD83陽性成熟榭状細胞に分離し、それぞ れにおいて、抗 Notchl抗体を用い、 Notchlの発現を FACSにて調べた。図 11に示 すように、成熟榭状細胞(図 11B上)では、未成熟榭状細胞(図 11A)より、 Notchlの 発現が高力つた。さらに、成熟榭状細胞において、 CD83と Notchlの発現を調べたと ころ、図 11B下に示すように、 CD83と Notchlの発現に相関が見られた。このように、 ヒト榭状細胞においても、細胞の成熟化に伴い、 Notchlの発現が亢進した。
産業上の利用可能性
[0075] 本発明によって、高効率に-ユーロスフエアを形成する-ユーロスフエア形成剤及 び障害が生じた神経機能を効率よく改善する医薬組成物を提供することが可能にな つた o

Claims

請求の範囲
[I] マウス CD8 a陽性榭状細胞を有効成分として含む-ユーロスフ ア形成剤。
[2] 成熟榭状細胞を有効成分として含む-ユーロスフ ア形成剤。
[3] Notch陽性榭状細胞を有効成分として含む-ユーロスフェア形成剤。
[4] 前記 Notch力Notchlであることを特徴とする請求項 3に記載の-ユーロスフェア形成 剤。
[5] 前記榭状細胞がマウス由来であり CD8 a陽性であることを特徴とする請求 2〜4の いずれかに記載の-ユーロスフェア形成剤。
[6] 前記榭状細胞がヒト由来であることを特徴とする請求 2〜4のいずれかに記載の-ュ 一口スフエア形成剤。
[7] 前記榭状細胞力 SNotch陽性であることを特徴とする請求項 1または 2に記載の-ュ 一口スフエア形成剤。
[8] 前記 Notch力Notchlであることを特徴とする請求項 7に記載の-ユーロスフェア形成 剤。
[9] マウス CD8 a陽性榭状細胞を有効成分として含有し、神経損傷によって障害が生 じた神経機能を改善することを特徴とする医薬組成物。
[10] 成熟榭状細胞を有効成分として含有し、神経損傷によって障害が生じた神経機能 を改善することを特徴とする医薬組成物。
[I I] Notch陽性榭状細胞を有効成分として含有し、神経損傷によって障害が生じた神経 機能を改善することを特徴とする医薬組成物。
[12] 前記 Notch力Notchlであることを特徴とする請求項 11に記載の医薬組成物。
[13] 前記榭状細胞がマウス由来であり CD8 a陽性であることを特徴とする請求項 10〜
12のいずれかに記載の医薬組成物。
[14] 前記榭状細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項 10〜12のいずれかに記載 の医薬組成物。
[15] 前記榭状細胞力 SNotch陽性であることを特徴とする請求項 9または 10に記載の医 薬組成物。
[16] 前記 Notch力Notchlであることを特徴とする請求項 15に記載の医薬組成物。
[17] 前記神経損傷が脊髄損傷であることを特徴とする請求項 9〜16のいずれかに記載 の医薬組成物。
[18] 前記神経機能が運動機能であることを特徴とする請求項 9〜17のいずれかに記載 の医薬組成物。
[19] Notch遺伝子関連物質である、榭状細胞サブタイプのマーカー。
[20] 前記 Notch遺伝子関連物質力 Notchl遺伝子関連物質であることを特徴とする請求 項 19に記載のマーカー。
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