WO2007114473A1 - シグナル伝達系活性化剤 - Google Patents
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- WO2007114473A1 WO2007114473A1 PCT/JP2007/057588 JP2007057588W WO2007114473A1 WO 2007114473 A1 WO2007114473 A1 WO 2007114473A1 JP 2007057588 W JP2007057588 W JP 2007057588W WO 2007114473 A1 WO2007114473 A1 WO 2007114473A1
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Definitions
- the present invention relates to an integrin 131 signal transduction system activator.
- neural stem cells cultured in vitro and proliferated are attracting attention as candidates for transplantation materials to replace the neural stem cells whose fetal power is also directly isolated.
- Neural stem cells are undifferentiated cells that have self-replicating ability and multipotency, and can be supplied in an infinite amount by in vitro culture, so that sufficient donor cells can be supplied.
- the present invention provides an activator of integrin ⁇ 1 signal transmission system in neural stem cells or neural progenitor cells, and maintenance, survival of neural stem cells or neural progenitor cells via integrin j81 signaling system, Or it was made for the purpose of providing the regulator which regulates differentiation.
- galectin 1 is one of the factors involved in proliferation of neural stem cells.
- attempts were made to identify a receptor for galectin-1 and as a result of diligent efforts, it was clarified that the receptor strength of galectin-1 was S integrin j81, and the present invention was completed.
- the activator that is effective in the present invention is an integral part of neural stem cells or neural progenitor cells.
- the activity method according to the present invention is an activity method for activating the integrin j81 signaling system in neural stem cells or neural progenitor cells under culture conditions, wherein It is characterized by administering.
- the regulator according to the present invention is a regulator that regulates maintenance, survival or differentiation of neural stem cells or neural progenitor cells, and is characterized by containing galectin-11.
- the regulation method that works in the present invention is a regulation method for regulating maintenance, survival or differentiation of neural stem cells or neural progenitor cells under culture conditions, characterized in that galectin 1 is administered to the cells. To do.
- FIG. 1 shows an experimental example demonstrating that integrin ⁇ 1 is a receptor for galectin 1.
- A Experimental example showing that galectin-1 binding to neural stem cells is inhibited by ratatoses in vivo.
- B This is an experimental example showing that intedarin j81 is bound to and eluted from the C2S-GAL-1 affinity column.
- C This is an experimental example showing that cells expressing integrin
- FIG. 2 is a graph showing the results of BrdU incorporation when galectin 1 was administered to the brain in Examples.
- A shows the administration method of BrdU and galectin-1 in the examples.
- B shows the results of visualization of proliferating cells in situ.
- C Shows the results of counting the number of BrdU positive nuclei.
- FIG. 3 is a graph showing the results of BrdU incorporation at the same time when galectin-11 and anti-integrin antibody were administered to the brain in Examples.
- (A) shows the results of visualization of proliferating cells in situ.
- (C) shows the results of counting the number of BrdU positive nuclei.
- Integrin is a receptor protein consisting of a subunit and 13 subunit heterodimer. Among them, integrin j81 plays a particularly important role in the development process. It has been shown to help.
- neural stem cells in the VZ (ventral zone) region first divide equally and then unequally divide into neural stem cells and the nerve cells, which work to maintain neural stem cells.
- ILK integrin-linked kinase
- ILK integrin-linked kinase
- E-cadherin and / 3catenin can suppress the transcriptional expression of E-cadherin and / 3catenin by enhancing the expression of the transcriptional repressor Snail / Slug. It is considered that this mechanism is used to enable the migration of cells in the VZ region, which are known to have a high level of E-cadherin and 13 catenin (Campos LS, Bioessays 27, 698-707). , 2005).
- Equal division and unequal division of neural stem cells in the VZ region can be regulated by regulating cell survival by unequal allocation of specific molecules.
- the basement membrane regulates PCD (programmed cell death), and the cells are in the vicinity of the basement membrane or in an environment where other survival factors (eg, growth factors) are present. Only cells that can survive will cause cell death in cells that have lost contact with the appropriate matrix.
- PCD is induced (Zhang Z., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6161-6165, 1995; Gilmore AP et al, J. Cell Biol. 149, 431-446, 200 0; Gary DS et al "J.
- integrin j8 1 (Prince JM et al., Dev. Dyn. 223, 497-516, 20 02), and free integrins induce caspase-8 in the membrane and activate it.
- binding of integrin Dalin inhibits the interaction of integrin caspases, you promotes cell survival (Stupack DG et al., J. cell Biol. 155, 459-470, 2004) 0
- alpha 3 beta 1 integrin by linker ⁇ active I signal transduction systems spoon are known to promote the survival of cells from (Manohar A. et al "J. cell Sci.
- Galectin 1 It is effective as a regulator that regulates differentiation.
- Integrin j8 1 constitutes a receptor for galectin 1
- C2S-GAL-l-bio piotinylated C2S galectin-1 (C2S-GAL-l-bio) (provided by AIST) in the presence of lactose. Tissue staining was performed.
- This C2S-GAL-1 is the second of galectin-1 (Hirabayashi & Kasai, J Biol Chem 266, 2364 8-23653 1991), which has already been shown to have normal hydrocarbon-binding ability (Purkrab kova et al. Biol Cell). 95, 535-545, 2003).
- mice from day 56 of 56 days old were removed and fixed by perfusion with a 4% formaldehyde solution, followed by postfixation with the same solution at 4 ° C overnight, and a 50 m vibratome section. It was created.
- a galectin-1 binding factor was isolated from the SVZ extract using a C2S-GAL-1 affinity column.
- C2S-GAL-1 affinity column recombinant C2S-GAL-1 was immobilized on an NHS activated Sepharose column (Amersham), placed in a 2 ml column, and PBS containing 2 mM EDTA and 4 mM 2-mercaptoethanol (ME-PBS). Equilibrated with On the other hand, after removing the brain from 5 adult mice, the tissue of SVZ was cut out under a stereomicroscope using a scalpel.
- the obtained SVZ tissue was crushed with a soaker, washed with ME-PBS containing 20 mM ratatoose (Wako), centrifuged, and the supernatant was removed three times. Finally, The solution was made into a solution with ME-PBS containing 1% Triton X-100, and injected into a column equilibrated with ME-PBS.
- ME with lOOmM ⁇ -methyl mannopyranoside (Sigma) wash the column with PBS to wash away nonspecifically bound molecules, and then ME with 20 mM ratose or lOOmM mannose (Wako) — Elution was attempted with PBS.
- integrin 1 In order to examine whether integrin 1 is present in the eluate, Western blotting was performed, and anti-integrin antibody (BD mouse anti-integrin ⁇ 1 IgG monoclona 1, diluted 100-fold) was used as the primary antibody. Integrin j81 was detected using HRP-labeled anti-mouse IgG (Jackson, 500-fold dilution) as an antibody. It was revealed that integrin j81 was not eluted in ME-PBS containing mannose (Fig. 1B). Combined with the fact that latato inhibits galectin-11 binding to the receptor, at least integrin j81 was thought to be a receptor for galectin-1 on neural stem cells.
- anti-integrin antibody BD mouse anti-integrin ⁇ 1 IgG monoclona 1, diluted 100-fold
- the vibratome section of the mouse brain was double-stained with C2S-Gal and an anti-integrin antibody (Pharmingen, diluted 10-fold).
- ABC kit Vectastain
- TSA PerkinElmer
- anti-mouse IgG antibody Jackson, diluted 500 times
- FIG. 1C cells expressing integrin j81 had an affinity for C2S-Ga ⁇ 1. This supports that the receptor for galectin 1 is integrin j81.
- SVZ a part of SVZ astrocytes functions as neural stem cells, undergoes intermediate differentiation TA cells (transit amplifying cells), and further differentiates into NB (neuroblasts) after cell proliferation. It is known. Since these neural stem cells are known to proliferate relatively slowly, neural stem cells can be identified by incorporating BrdU over a long period of time.
- the galectin solution was administered to the lateral ventricle for 7 consecutive days at a rate of 0.5 1 / h using an osmotic pump with force-yure inserted into the position (FIG. 2A).
- proliferating cells were visualized by taking BrdU into the long-term force of neural stem cell proliferation.
- drink 7 mg of galectin 1 Figure 2B, C
- 7 mg of water containing lmgZml BrdU during 7 days of continuous administration of galectin-1 and anti-integrin j81 antibody Figure 3A, B. It was given as water (Figure 2A).
- mice 17 and 37 days after the last day of administration ( Figure 2B, C), or 17 days ( Figure 3A, B), remove the brain, and remove the vibratome in the SVZ area as described above. It was created.
- Rat anti-BrdU monoclonal antibody (Abeam: hrat monoclonal antibody [BU 1/75 (ICR)], diluted 100-fold) as primary antibody, Piotin-labeled anti-rat IgG antibody (Jackson, 100-fold diluted) as secondary antibody )
- LSM-510, Zeiss a confocal laser microscope
- mice treated with anti-integrin / 31 antibody had no treatment, and the number of cells that proliferated significantly more slowly in SVZ was reduced compared to mice. (Poku 0. 05). These results indicate that administration of anti-integrin j81 antibody into the brain reduces the number of neural stem cells.
- galectin 1 was administered and anti-integrin j8 1 antibody was administered, galectin 1 had no effect and the number of cells proliferating significantly decreased (p ⁇ 0. 05). From these results, it was shown that the decrease in the number of neural stem cells by anti-integrin antibody is due to the anti-integrin ⁇ 1 antibody inhibiting the interaction between galectin 1 and integrin j81.
- integrin j81 is a receptor for galectin-1 and that galectin-1 binds to integrin
- an activator of an integrin signaling system in neural stem cells or neural progenitor cells and a regulator that regulates maintenance, survival, or differentiation of neural stem cells or neural progenitor cells via the integrin j81 signaling system can be provided.
Abstract
本発明は、神経幹細胞または神経前駆細胞における、インテグリンシグナル伝達系の活性化剤およびその利用方法を提供することを目的とする。そのため、ガレクチン－１を含有した、インテグリンシグナル伝達系の活性化剤とする。この活性化剤は、神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節する調節剤として利用可能である。
Description
明 細 書
シグナル伝達系活性化剤
技術分野
[0001] 本発明はインテグリン 13 1シグナル伝達系活性化剤に関する。
背景技術
[0002] 障害を起こした中枢神経系の再生は困難であるが、動物実験では胎児組織、特に 神経幹細胞の移植が有用であることが報告されている。しかし、治療に十分な神経 幹細胞を得るには多数の中絶胎児の献体を必要とする上に、胎児の使用に倫理面 での問題があるため、現実的な臨床応用は難 、。
[0003] そこで、胎児力も直接単離した神経幹細胞に代わる移植材料の候補として、体外 で培養し、増殖させた神経幹細胞が注目されて 、る。神経幹細胞は自己複製能と多 分化能を有する未分化な細胞であり、体外で培養することにより無尽蔵に増殖するた め、十分なドナー細胞の供給が可能である。
[0004] 神経幹細胞や神経前駆細胞における、細胞維持（maintenance)、細胞生存（surviv al)、細胞増殖 (proliferation)、細胞分化（differentiation)には、インテグリン 13 1が重 要な役昔1 J 果 7こし飞いる (し ampos L.S. Betal integrins and neural stem cells: makin g sense of the extracellular environment. Bioessays vol.27 No.7 p.698— 707, 2005; J acques T.S. et al. Neural precursor cell chain migration and division are regulated t hrough different beta丄 integrins." Development vol.125 No. lb p.3167— 3177, 1998; imond C. et al. "Defects in adhesion and migration, but not in proliferation and diff erentiation, of embryonic stem cells upon replacement of integrin subunit betalA by beta ID." Differentiation. Vol.66 No.2— 3 p.93— 105, 2000; Prestoz L. et al. "Associa tion between integrin— dependent migration capacity of neural stem cells in vitro and anatomical repair following transplantation. Mol. Cell Neurosci. Vol.18 No.5 p.473- 484, 2001; Murase S. and Horwitz A.F. "Deleted in colorectal carcinoma and differe ntially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in t he rostral migratory stream." J. Neurosci. Vol.22 No.9 p.3568— 3579, 2002; Yoshida
N, et al. "Decrease in expression of alpha 5 beta 1 integrin during neuronal different iation of cortical progenitor cells." Exp. Cell Res. Vol.287 No.2 p.262-271, 2003; C ampos L.S. et al. "Betal integrins activate a MAPK signalling pathway in neural ste m cells that contributes to their maintenance." Development. Vol.131 No.14 p.3433 -3444, 2004; Yanagisawa M. et al. "Roles of lipid rafts in integrin- dependent adhesi on and gpl30 signalling pathway in mouse embryonic neural precursor cells." Genes Cells. Vol.9 No.9 p.謝 - 809, 2004; Tate M.C. et al. "Specific betal integrins media te adhesion, migration, and differentiation of neural progenitors derived from the em bryonic striatum, Mol. Cell Neurosci. Vol.27 No.l p.22- 31, 2004; Andressen C. et al. The contribution of betal integrins to neuronal migration and differentiation de pends on extracellular matrix molecules." Eur. J. Cell Biol. Vol.84 No.12 p.973- 982 , 2005; Campos L.S. et al. Notch, EGFR ana beta 丄 integrin pathways are coordina tea in neural stem cells." J. Biol. し hem. accepted manuscript version (2005 Dec 6)) 。そこで、インテグリン j8 1シグナル伝達系を調節することにより、神経幹細胞や神経 前駆細胞の細胞維持、細胞生存、細胞増殖、あるいは細胞分化を調節できるように なると考免られる。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] そこで、本発明は、神経幹細胞または神経前駆細胞における、インテグリン β 1シグ ナル伝達系の活性化剤、及びインテグリン j8 1シグナル伝達系を介して神経幹細胞 または神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節する調節剤を提供することを 目的としてなされた。
課題を解決するための手段
[0006] 発明者らは、ガレクチン 1が神経幹細胞の増殖に関わる因子の一つであることを すでに明らかにしている。そこで、ガレクチン— 1の受容体の同定を試み、鋭意努力 の結果、ガレクチン一 1の受容体力 Sインテグリン j8 1であることを明らかにし、本発明の 完成に至った。
[0007] 本発明に力かる活性化剤は、神経幹細胞または神経前駆細胞にぉ 、て、インテグ
リンシグナル伝達系を活性ィ匕する活性化剤であって、ガレクチン 1を含有すること を特徴とする。また、本発明にかかる活性ィ匕方法は、培養条件下の神経幹細胞また は神経前駆細胞において、インテグリン j8 1シグナル伝達系を活性ィ匕する活性ィ匕方 法であって、前記細胞にガレクチン 1を投与することを特徴とする。
[0008] さらに、本発明にかかる調節剤は、神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存 または分ィ匕を調節する調節剤であって、ガレクチン一 1を含有することを特徴。また、 本発明に力かる調節方法は、培養条件下の神経幹細胞または神経前駆細胞の維持 、生存または分ィ匕を調節する調節方法であって、前記細胞にガレクチン 1を投与 することを特徴とする。
[0009] = =関連文献とのクロスリファレンス = =
なお、本出願は、 2006年 4月 5日出願の日本国出願番号特願 2006— 104610を 基礎とする優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。 図面の簡単な説明
[0010] [図 1]インテグリン β 1がガレクチン 1の受容体であることを証明する実験例を示した 図である。 （A) in vivoで、神経幹細胞に対するガレクチン 1の結合がラタトースによ つて阻害されることを示す実験例である。 (B) C2S-GAL-1ァフィ-ティカラムにインテ ダリン j8 1が結合し、溶出されることを示す実験例である。（C)インテグリン |8 1を発現 して 、る細胞は、ガレクチン— 1に対する親和性を有することを示す実験例である。
[図 2]実施例において、ガレクチン 1を脳に投与した場合、同時に BrdUを取り込ま せた結果を示す図である。 （A)実施例における、 BrdU及びガレクチン— 1の投与方 法を示す。（B)増殖細胞を in situで可視化した結果を示す。（C) BrdU陽性核の数を 数えた結果を示す。
[図 3]実施例において、ガレクチン一 1と抗インテグリン抗体を脳に投与した場合、同 時に BrdUを取り込ませた結果を示す図である。（A)増殖細胞を in situで可視化した 結果を示す。（C) BrdU陽性核の数を数えた結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] インテグリンは aサブユニットと 13サブユニットのヘテロダイマーからなる受容体タン ノ ク質である。中でも、インテグリン j8 1は、発生過程において、特に重要な役割を果
たすことが示されてきた。
[0012] = =神経幹細胞または神経前駆細胞の維持を調節する調節剤 = =
発生過程にある大脳皮質においては、 VZ (ventral zone)領域の神経幹細胞は、ま ず等分裂した後に神経幹細胞と神経前記細胞に不等分裂をし、神経幹細胞の維持 に働く。インテグリン j8 1と相互作用する細胞内タンパク質である ILK (integrin-linked kinase)は転写抑制因子 Snail/Slugの発現を亢進することにより、 Eカドヘリンと /3カテ ニンの転写の発現を抑制することが知られている力 Eカドヘリンと 13カテニンを高発 現している VZ領域の細胞が移動できるようになるのは、このメカニズムを利用してい ることが考えられる（Campos L.S., Bioessays 27, 698-707, 2005)。一方、 FGF2の存 在下で βカテニンを過剰発現させると、神経前駆細胞を増殖させ続けること、また FG F2の非存在下で βカテニンを過剰発現させると、神経前駆細胞を神経分化の方向 に向かわせることが知られている力 神経前駆細胞に FGFを投与すると、インテグリ ン j8 1の発現が亢進することから、 j8カテニンの効果に FGF2が関与するのは、部分 的に、細胞間、あるいは細胞 ECM間の微小環境によると考えられる。これらの結 果から、 VZにおいてタンパク質相互作用のネットワークが機能し、インテグリン /3 1シ グナル伝達系は他のシグナル伝達系とのクロストークを通じて、神経幹細胞を維持す る力、それとも分ィ匕したり移動したりする力、の選択を行なうと考えられている（Campos L.S., Bioessays 27, 698—707, 2005)。
[0013] 従って、ガレクチン 1によってインテグリン j8 1を活性ィ匕することにより、神経幹細 胞または神経前駆細胞の状態を維持することが可能となり、ガレクチン 1は、神経 幹細胞または神経前駆細胞の維持を調節する調節剤として有効である。
[0014] = =神経幹細胞または神経前駆細胞の生存を調節する調節剤 = =
VZ領域の神経幹細胞の等分裂と不等分裂は、特定の分子を不等配分することに より、細胞の生存を調節することにより調節しうる。発生過程では、基底膜が PCD (pr ogrammed cell death)を調節していることが知られており、基底膜の近くや他の生存 因子 (例えば、増殖因子）が存在している環境にある細胞だけが生存できるため、適 当なマトリックスとの接触を失った細胞では、細胞死が引き起こされる。実際、インテグ リンシグナル伝達系がなくなると、 PCDが誘導されたり（Zhang Z., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92, 6161-6165, 1995; Gilmore A.P. et al, J. Cell Biol. 149, 431—446, 200 0; Gary D.S. et al" J. Neurochem 84, 878-890, 2003)、インテグリン j8 1の構造変化 がアポトーシスを引き起こしたりする（Prince J.M. et al., Dev. Dyn. 223, 497-516, 20 02)。また、フリーのインテグリンは、カスパーゼ一 8を膜に誘導して活性ィ匕し、インテ ダリンの結合はインテグリン カスパーゼの相互作用を阻害し、細胞の生存を促進す る（Stupack D.G. et al., J. Cell Biol. 155, 459-470, 2004) 0さらに、 α 3 β 1インテグリ ンカ ΜΑΡΚシグナル伝達系を活性ィ匕することにより、細胞の生存を促進することが 知られている（Manohar A. et al" J. Cell Sci. 117, 4043-4054, 2004) 0これらの結果 から、 in vivoでも、神経幹細胞または神経前駆細胞の生存は、インテグリン j8 1を高 発現している VZにおいて、インテグリン j8 1によって維持されていると考えられている (Campos L.S., Bioessays 27, 698—707, 2005)。
[0015] 従って、ガレクチン 1によってインテグリン j8 1を活性ィ匕することにより、神経幹細 胞または神経前駆細胞の生存を維持することが可能となり、ガレクチン 1は、神経 幹細胞または神経前駆細胞の生存を調節する調節剤として有効である。
[0016] = =神経幹細胞または神経前駆細胞の分化を調節する調節剤 = =
最近、神経前駆細胞においてインテグリン j8 1の発現レベルを下げると、ネスチン 陽性細胞が減少することが明らかになった（Leone D. et al. J. Cell Sci. 118, 2005)。 ネスチンは、神経幹細胞あるいは神経前駆細胞の未分ィヒ状態のマーカーであり、こ の実験結果は、インテグリン j8 1が神経幹細胞及び神経前駆細胞の未分化状態の維 持に必要であることを示す。
[0017] 従って、ガレクチン 1によってインテグリン j8 1を活性ィ匕することにより、神経幹細 胞または神経前駆細胞の未分化状態を維持することが可能となり、ガレクチン 1は 、神経幹細胞または神経前駆細胞の分化を調節する調節剤として有効である。 実施例
[0018] く実施例 1 >インテグリン j8 1はガレクチン 1の受容体を構成する
神経幹細胞に対するガレクチン 1の結合に糖が関与しているかどうかを調べるた め、ピオチン化 C2Sガレクチン— 1 (C2S-GAL-l-bio) (産総研より提供）を用いて、ラ クトースの存在下で組織染色を行った。この C2S-GAL-1は、ガレクチン— 1の 2番目
のシスティンをセリンに置換した変異体（Hirabayashi & Kasai, J Biol Chem 266, 2364 8-23653 1991)で、正常な炭化水素結合能を有することが既に示されている（Purkrab kova et al. Biol Cell 95, 535-545, 2003)。
[0019] まず、生後 56日カゝら 105日目のマウスの脳を取り出し、 4%ホルムアルデヒド溶液で 灌流固定した後、 4°Cで一晩、同溶液で後固定し、 50 mのビブラトーム切片を作成 した。
[0020] この切片を、 20mMラタトース存在下で、 0. 5%Triron X-100及び 1%BSAを含有 する PBSに溶解させた 1 μ g/mL C2S-GAL-l-bio溶液中で、 4°Cでー晚インキュべ ートし、 ABCキット（Vectastain社）と TSA (PerkinElmer社）を用いて蛍光染色したとこ ろ、ラタトースを含まないコントロールと比べて、シグナルが有意に弱くなつた (図 1A) 。このことは、神経幹細胞に対するガレクチン 1の結合カ^クトースによって阻害さ れることを示す。
[0021] このラタトースによる結合阻害のメカニズムを探り、ガレクチン 1の結合因子を同定 するため、 C2S-GAL-1ァフィ-ティカラムを用いて、 SVZの抽出物からガレクチン一 1 結合因子を単離した。まず、組換え C2S-GAL-1を NHS活性化セファロースカラム (A mersham社）に固定し、容積 2mlのカラムに入れ、 2mM EDTA及び 4mMの 2—メ ルカプトエタノールを含む PBS (ME— PBS)で平衡化した。一方、 5匹の成体マウス から、脳を摘出後、眼下用メスを用いて実体顕微鏡下で、 SVZの組織を切り出した。 得られた SVZ組織をソ-ケイタ一で破砕後、 20mM ラタトース (Wako社）を含む ME — PBSでピペッティングし、遠心分離して上清を除去するという洗浄工程を 3回行い 、最後に、 1% Triton X-100を含む ME— PBSで溶液状にし、 ME— PBSで平衡ィ匕 したカラムに注入した。 lOOmM α—メチルマンノピラノシド（Sigma社）を含む ME— PBSでカラムを洗浄し、非特異的に結合した分子を洗い流した後、 20mM ラタトー スまたは lOOmM マンノース（Wako社）を含む ME— PBSで溶出を試みた。溶出液 中にインテグリン 1が存在するかどうか調べるため、ウェスタン 'ブロッテイングを行 い、 1次抗体として抗インテグリン抗体（BD社マウス anti-integrin β 1 IgG monoclona 1、 100倍希釈）を、 2次抗体として HRP標識抗マウス IgG (Jackson社、 500倍希釈）を 用いて、インテグリン j8 1を検出したところ、ラタトースを含む ME— PBSで、インテグリ
ン j8 1が溶出されたが、マンノースを含む ME— PBSでは、インテグリン j8 1は溶出さ れないことが明らかになった (図 1B)。ラタトースはガレクチン一 1が受容体に結合する のを阻害することと考え合わせると、少なくともインテグリン j8 1は、神経幹細胞上のガ レクチン 1の受容体であると考えられた。
[0022] そこで、上記マウス脳のビブラトーム切片に対し、 C2S-Ga lと抗インテグリン抗体（ Pharmingen社、 10倍希釈）で二重染色をした。 C2S- Ga卜 1の検出には、 ABCキット（ Vectastain社)及び TSA (PerkinElmer社）を用い、インテグリンの検出には、二次抗 体として、抗マウス IgG抗体 (Jackson社、 500倍希釈）を用いた。図 1Cに示すように、 インテグリン j8 1を発現している細胞は、 C2S-Ga卜 1に対する親和性を有していた。こ のことは、ガレクチン 1の受容体はインテグリン j8 1であることを支持する。
[0023] く実施例 2 >抗インテグリン |8 1抗体は、ガレクチン 1とインテグリン j8 1の相互作用 を阻害する
SVZにおいては、 SVZァストロサイトの一部は神経幹細胞として機能し、中間分ィ匕 段階の TA細胞（transit amplifying cells)を経て、さらに細胞増殖の後、 NB (神経芽 細胞)へと分化することが知られている。この神経幹細胞は、比較的ゆっくり増殖する ことが知られているため、長期的に BrdUを取り込ませることにより、神経幹細胞を同定 することができる。
[0024] 一方、ガレクチン 1をマウス脳に投与すると、 SVZにおける神経幹細胞の増殖が 促進する（国際公開 WO2005/026343公報)。そこで、ガレクチン 1とインテグリン 1の相互作用の阻害が、神経幹細胞の増殖にどのような影響がある力調べた。
[0025] まず、組換えガレクチン一 1 (R&D Systems社）（2または 14 μ g)、抗ガレクチン中和 抗体 (キリンより供与、ゥサギ IgG、 30 /z gZml)ガレクチンを認識しないコントロール 抗体 (キリンより供与、ゥサギ IgG、 30 /^ 1111)、抗ィンテグリン|8 1抗体^0社、ノヽ ムスター IgM、 10 μ g/ml)、インテグリン 13 1を認識しないコントロール抗体（BD社、 ハムスター IgM、 10 μ g/ml)を lmg/mlのマウス血清アルブミン（Sigma社）を含む 0. 9%食塩水に溶解し、脳定位手術によって bregmaから後ろ 0. 2mm、外側 0. 8m m、深さ 2. Ommの位置に力-ユーレを揷入し、 osmotic pumpを用いて、 0. 5 1/h の速度でガレクチン溶液を側脳室に 7日間連続投与した（図 2A)。
[0026] これらの場合に、神経幹細胞の増殖がどうなる力、長期的に BrdUを取り込ませるこ とにより、増殖細胞を可視化した。まず、ガレクチン 1(図 2B, C) 7日間の連続投与 、またはガレクチン— 1と抗インテグリン j8 1抗体（図 3A, B)の 7日間の連続投与の間 、 lmgZmlの BrdUを含む水を、飲み水として与えた (図 2A)。投与の最後の日から 1 7日後と 37日後に (図 2B, C)、または 17日後に（図 3A, B)マウスを解剖し、脳を取り 出し、上述のように SVZの領域でビブラトーム切片を作成した。 1次抗体として、ラット 抗 BrdUモノクローナル抗体（Abeamネ: hrat monoclonal antibody[BU 1/75(ICR)]、 100 倍希釈）、 2次抗体として、ピオチン標識抗ラット IgG抗体 (Jackson社、 100倍希釈)を 用い、コンフォーカルレーザー顕微鏡（LSM- 510, Zeiss)で観察した（図 2B及び図 3 A)。また、シグナルを定量化するために、 SVZ領域で（bregma +0〜+1) 7 μ mごとに 1 mの断面を取り、 BrdU陽性の核の数を数え、グラフに表した（図 2C、図 3B)。
[0027] 図 2B, Cに示すように、ガレクチン 1を投与したマウスでは、 17日後及び 37日後 の両方において、無処理のコントロール 'マウスより、 SVZにおいて、有意にゆっくりと 増殖する細胞の数が増えていた（17日目 p = 0. 01 ; 37日目 p< 0. 001)。この結 果より、ガレクチン 1の脳内への投与は、神経幹細胞の数を増やすことが示された
[0028] また、図 3A, Bに示すように、抗インテグリン /3 1抗体を投与したマウスでは、無処 理のコントロール.マウスより、 SVZにおいて、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が 減っていた (Pく 0. 05)。この結果より、抗インテグリン j8 1抗体の脳内への投与は、 神経幹細胞の数を減らすことが示された。
[0029] し力も、ガレクチン 1を投与しても、抗インテグリン j8 1抗体を投与すると、ガレクチ ン 1の効果は生じず、有意にゆっくりと増殖する細胞の数が減っていた (p < 0. 05 )。この結果より、抗インテグリン抗体による神経幹細胞数の減少は、抗インテグリ β 1 抗体が、ガレクチン 1とインテグリン j8 1の相互作用を阻害することによることが示さ れた。
[0030] <結論 >
これらの結果から、神経幹細胞または神経前駆細胞において、インテグリン j8 1は ガレクチン一 1の受容体であり、ガレクチン一 1がインテグリン |8 1に結合することによ
り、インテグリンシグナル伝達系を活性ィ匕することが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明によって、神経幹細胞または神経前駆細胞における、インテグリンシグナル 伝達系の活性化剤、及びインテグリン j8 1シグナル伝達系を介して神経幹細胞また は神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節する調節剤を提供することが可能 となった。
Claims
[1] 神経幹細胞または神経前駆細胞にぉ 、て、インテグリン β 1シグナル伝達系を活性 化する活性化剤であって、
ガレクチン 1を含有することを特徴とする活性化剤。
[2] 神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節する調節剤であ つて、
ガレクチン 1を含有することを特徴とする調節剤。
[3] 培養条件下の神経幹細胞または神経前駆細胞にお!、て、インテグリン β 1シグナ ル伝達系を活性ィ匕する活性ィ匕方法であって、
前記細胞にガレクチン 1を投与することを特徴とする活性ィ匕方法。
[4] 培養条件下の神経幹細胞または神経前駆細胞の維持、生存、または分化を調節 する調節方法であって、
前記細胞にガレクチン 1を投与することを特徴とする調節方法。
Priority Applications (1)
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Citations (2)
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